膜片鉗技術(shù)∶從一小片(約幾平方微米)膜獲取電子學方面信息的技術(shù),即保持跨膜電壓恒定——電壓鉗位,從而測量通過膜離子電流大小的技術(shù)。通過研究離子通道的離子流,從而了解離子運輸、信號傳遞等信息?;驹恚豪秘摲答侂娮泳€路,將微電極前列所吸附的一個至幾個平方微米的細胞膜的電位固定在一定水平上,對通過通道的微小離子電流作動態(tài)或靜態(tài)觀察,從而研究其功能。研究離子通道的一種電生理技術(shù),是施加負壓將玻璃微電極的前列(開口直徑約1μm)與細胞膜緊密接觸,形成高阻抗封接,可以精確記錄離子通道微小電流。能制備成細胞貼附、內(nèi)面朝外和外面朝內(nèi)三種單通道記錄方式,以及另一種記錄多通道的全細胞方式。膜片鉗技術(shù)實現(xiàn)了小片膜的孤立和高阻封接的形成,由于高阻封接使背景噪聲水平**降低,相對地增寬了記錄頻帶范圍,提高了分辨率。另外,它還具有良好的機械穩(wěn)定性和化學絕緣性。而小片膜的孤立使對單個離子通道進行研究成為可能。 由于電極前列與細胞膜的高阻封接,在電極前列籠罩下的那片膜事實上與膜的其他部分從電學上隔離。德國單通道膜片鉗實驗操作
膜片鉗放大器的工作模式;(1)電壓鉗模式∶在鉗制細胞膜電位的基礎(chǔ)上改變膜電位,記錄離子通道電流的變化,記錄的是諸如通道電流;EPSC;IPSC等電流信號。是膜片鉗的基本工作模式.(2)屯流鉗素向細胞內(nèi)注入刺激電流,記錄膜電位對刺激電流的反應。記錄的是諸如動作電位,EPSP;IPSP等電壓信號。膜片鉗技術(shù)實現(xiàn)膜電位固定的關(guān)鍵是在玻璃微電極前列邊緣與細胞膜之間形成高阻(10GΩ)密封,使電極前列開口處相接的細胞膜片與周圍環(huán)境在電學上隔離,并通過外加命令電壓鉗制膜電位。日本細胞膜片鉗專題膜片鉗通常由兩個平行的、彎曲的鉗臂組成,鉗臂的末端有一對夾持墊,可以夾住薄片材料。
電壓鉗的缺點∶電壓鉗技術(shù)目前主要用于巨火細胞的全細胞電流研究,特別在分子克隆的卵母細胞表達電流的鑒定中發(fā)揮其它技術(shù)不能替代的作用。但也有其致命的弱點1、微電極需刺破細胞膜進入細胞,以致造成細胞漿流失,破壞了細胞生理功能的完整性;2、不能測定單一通道電流。因為電壓鉗制的膜面積很大,包含著大量隨機開放和關(guān)閉著的通道,而且背景噪音大,往往掩蓋了單一通道的電流。3、對體積小的細胞(如哺乳類***元,直徑在10-30μm之間)進行電壓鉗實驗,技術(shù)上有更大的困難。由于電極需插入細胞,不得不將微電極的前列做得很細,如此細的前列致使電極阻抗很大,常常是60~-8OMΩ或120~150MΩ(取決于不同的充灌液)。這樣大的電極阻抗不利于作細胞內(nèi)電流鉗或電壓鉗記錄時在短時間(0.1μs)內(nèi)向細胞內(nèi)注入電流,達到鉗制膜電壓或膜電流之目的。再者,在小細胞上插入的兩根電極可產(chǎn)生電容而降低測量電壓電極的反應能力。
膜片鉗技術(shù)是神經(jīng)科學領(lǐng)域非常重要的一項技術(shù),1976年由國馬普生物物理研究所Neher和Sakmann發(fā)明,從而在活細胞上記錄到單個離子通道的電流。近半個世紀來,膜片鉗技術(shù)已經(jīng)成為神經(jīng)科學領(lǐng)域較常用也是較實用的技術(shù)之一,具有極大的精確性和靈活性,能夠揭示離子通道,單細胞突觸反應,及神經(jīng)環(huán)路連接等多層次的電生理特性。做過膜片鉗的人都知道,膜片鉗的信號采集設(shè)備一般由前置放大器,放大器,模數(shù)/數(shù)模轉(zhuǎn)換器等構(gòu)成,神經(jīng)元電信號先通過前置放大器(headstage)初步放大,后傳輸入放大器進一步放大,再傳入模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號,后被計算機采集。下圖顯示的是我們較常使用的AXON和HEKA膜片鉗的一個信號傳輸路徑。膜片鉗技術(shù),讓離子通道研究變得更加準確與高效!
全細胞膜片鉗記錄(Whole-cellpatch-clamprecording)是一種早期且使用頻繁的鉗夾技術(shù),相當于連續(xù)單電極電壓鉗夾記錄,也就是說,全細胞記錄類似于傳統(tǒng)的細胞內(nèi)記錄,但具有更大的優(yōu)勢,如分辨率高、噪聲低、穩(wěn)定性好、細胞內(nèi)成分可控等。全細胞記錄技術(shù)測量一個細胞內(nèi)所有通道的電流,記錄過程中電極的溶液代替原生質(zhì)的成分。雖然膜片鉗記錄技術(shù)相對于原來的單電極電壓鉗有了很大的進步,尤其是在單離子通道鉗記錄中,細胞或腦片的組織選擇和實驗溶液的制備仍然是非常重要的步驟。全自動膜片鉗技術(shù)采用的標本必須是懸浮細胞,像腦片這類標本無法采用。美國雙分子層膜片鉗實驗操作
屯流鉗素向細胞內(nèi)注入刺激電流,記錄膜電位對刺激電流的反應。德國單通道膜片鉗實驗操作
膜片鉗技術(shù)實現(xiàn)了小片膜的孤立和高阻封接的形成,由于高阻封接使背景噪聲水平降低,相對地增寬了記錄頻帶范圍,提高了分辨率。另外,它還具有良好的機械穩(wěn)定性和化學絕緣性。而小片膜的孤立使對單個離子通道進行研究成為可能。單通道電流1.典型的單通道電流呈一種振幅相同而持續(xù)時間不等的脈沖樣變化。他有兩個電導水平,即O和1,分別對應通道的關(guān)閉和開效狀態(tài)。2.有的矩形脈沖簇狀發(fā)放時,通道電流不在同一水平,可以明顯觀察到不同數(shù)目離子通道所形成的電流臺階,從而可推斷出被測膜片的通道數(shù)目。3.有的通道可記錄到圓滑型和方波形兩種形式。4.有些通道開放活動是持續(xù)開放,中間被閃動樣的關(guān)閉所中斷,形成burst開放。有些通道開放活動是簇狀開放與短期平靜交替出現(xiàn),形成簇狀發(fā)放串(Cluster)德國單通道膜片鉗實驗操作