有了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡可以發(fā)揮更好的作用。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)波長較長的光子，使電子躍遷到更高的能級。短時(shí)間后，電子跳回到較低的能級，發(fā)出波長為長波長一半的光子(P=h/λ)。利用這個(gè)原理，雙光子激發(fā)技術(shù)誕生了。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光通過物鏡會聚。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，物鏡焦點(diǎn)處的光子密度比較高，所以雙光子激發(fā)只能發(fā)生在焦點(diǎn)處產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光穿過物鏡，被光學(xué)探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的。美國熒光雙光子顯微鏡

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。深要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問題，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫，這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細(xì)胞，使掃描能更好地進(jìn)行。美國熒光激光雙光子顯微鏡的原理雙光子顯微鏡使用方法是什么？

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問題，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本的“透明度”得到提高。

為了驗(yàn)證動物生物樣品的時(shí)間分辨成像能力，本實(shí)驗(yàn)觀察了活海拉細(xì)胞高爾基體中的青色熒光蛋白mTFP1，見圖3(a),(c)-(i)。使用的物鏡及尺寸與熒光顆粒成像一致，對比可見v2PE在空間分辨率、激發(fā)深度級圖像對比度較常規(guī)寬場顯微鏡都有所提高。此外，v2PE可以同時(shí)激發(fā)多個(gè)波長的熒光蛋白，這種技術(shù)還可以應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)分子的三維動力學(xué)多色成像。在此基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)對海拉細(xì)胞中的高爾基體(mTFP1)和纖顫蛋白(EGFP)進(jìn)行了在體成像，見圖3(j)-(n)，青色為mTFP1,綠色為EGFP，實(shí)驗(yàn)中兩種熒光蛋白同時(shí)成像，終采用光譜分離法將不同蛋白的熒光信號分離出來。雙光子顯微鏡的應(yīng)用中，該如何選擇以及更好的使用PMT。

王愛民副教授結(jié)合工作實(shí)例，展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應(yīng)用。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，重量只為2.2克，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰、穩(wěn)定的圖像，該顯微鏡適于佩戴在小動物頭部，可實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動態(tài)信號，在大型動物上，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時(shí)程觀測。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景，首先雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像，在亞微米級成像，此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r(shí)、在體、原位、無創(chuàng)地，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性，區(qū)分成像；雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行生化指標(biāo)成像，在無造影劑的前提下，利用自發(fā)熒光、二次諧波、熒光獲得活細(xì)胞生化信息。由于其非侵入性和高分辨率的特點(diǎn)，雙光子顯微鏡成為了研究神經(jīng)科學(xué)、ai癥研究、免疫學(xué)等領(lǐng)域的重要工具。熒光雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

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2020年，臨研所、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，獲學(xué)士、碩士學(xué)位，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用，為未來即時(shí)病理、離體組織檢測、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。美國熒光雙光子顯微鏡