實驗從理論和實驗上評估了多焦點v2PE顯微鏡的空間分辨率,并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對比,實驗中v2PE的激發(fā)波長為521nm,使用放大倍率為100倍的物鏡,尺寸為0.6AU,對直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測試性成像,共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177nm和297nm,這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率,模擬計算顯示v2PE點擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,軸向的半高寬較1PE減少,可以提高空間分辨率。雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡,其原理大致是這樣的;國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術(shù)
雙光子的來源:飛秒激光的雙光子吸收理論早在1931年就由諾貝爾獎獲得者M(jìn)ariaGoeppertMayer提出,并在30年后因為激光而得到實驗驗證,但WinfriedDenk用了近30年才發(fā)明了雙光子顯微鏡。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,首先要理解非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生的非線性過程,需要極高的電場強(qiáng)度,電場取決于聚焦光斑的大小和激光脈沖寬度。聚焦光斑越小,脈沖寬度越窄,雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,聚焦在樣品上的光斑大小只與物鏡NA和激光波長有關(guān),所以關(guān)鍵變量只有激光脈沖寬度?;谝陨戏治觯軌蜉敵龈咧貜?fù)率(100MHz)的超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光已經(jīng)成為雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這再次顯示了雙光子顯微鏡的優(yōu)勢:雙光子吸收只能在焦平面形成,而在焦平面之外,由于光強(qiáng)較低,無法激發(fā),所以雙光子成像更清晰。國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術(shù)優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)。
雙光子顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下,熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子,經(jīng)過短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后,發(fā)射一個波長較短的光子;效果和用波長為長波長一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優(yōu)點是具有更深的組織穿透深度,紅外光可以在平面上探測到極限為1mm的組織區(qū)域;因為信號背景比高,所以具有更高的對比度;由于激發(fā)體積小,具有定點激發(fā)、光毒性小的特點;激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),更加安全。
有了雙光子激發(fā)技術(shù),激光共聚掃描顯微鏡可以發(fā)揮更好的作用。那么,什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢?在光子密度較高的情況下,熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子,使電子躍遷到更高的能級。短時間后,電子跳回到較低的能級,發(fā)出波長為長波長一半的光子(P=h/λ)。利用這個原理,雙光子激發(fā)技術(shù)誕生了。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光通過物鏡會聚。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,物鏡焦點處的光子密度比較高,所以雙光子激發(fā)只能發(fā)生在焦點處產(chǎn)生熒光,該點產(chǎn)生的熒光穿過物鏡,被光學(xué)探頭接收,從而達(dá)到逐點掃描的效果。雙光子顯微鏡的原理是什么?
首先,雙光子成像采用波長范圍約在700~1000 nm的近紅外光激發(fā),在組織中的散射系數(shù)較小,穿透性很好,因此非常適合厚樣本的觀察。同時,由于是近紅外光激發(fā),也能避免樣品中激發(fā)波長較短的自發(fā)熒光物質(zhì)的干擾,可獲得較強(qiáng)的熒光信號(如下圖)。所以雙光子成像具有較深的穿透力和較小的光毒性。通常在活物腦組織中雙光子顯微鏡有效成像深度可達(dá)200~500 μm,能夠較好地進(jìn)行三維成像。雙光子成像的另一大優(yōu)勢在于精確的空間點聚焦性。一般條件下,物質(zhì)只會被單光子激發(fā),只有在光子密度足夠高的情況下,物質(zhì)才會吸收兩個光子從而被激發(fā),所以,雙光子只會在光子密度蕞高的物鏡焦點附近發(fā)生,很少產(chǎn)生焦平面外的雜散光(如下圖)。這種性質(zhì)既提高了成像質(zhì)量,也降低了樣本的光漂白、光損傷區(qū)域。基于這些優(yōu)勢,使得雙光子顯微鏡非常適合對活細(xì)胞、活組織進(jìn)行長時間在體成像。微型雙光子顯微鏡的優(yōu)勢是。美國bruker雙光子顯微鏡廠家電話
雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器。國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術(shù)
在深度組織中以較長時間對活細(xì)胞成像,雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記,使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是,共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,通過單光子激發(fā)熒光,而雙光子使用飛秒激光器,通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢:雙光子比共聚焦使用的更長的波長,所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米,雙光子則能達(dá)到250到500微米,甚至超過1毫米。另外,同時吸收兩個光子意味只有較強(qiáng)度聚焦點處能被激發(fā),所以不會損傷焦平面之外的組織,并且生成更清晰的圖像。國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像技術(shù)