生物樣品的三維觀察是了解細(xì)胞功能的重要方法之一。目前已有的三維熒光成像技術(shù)有光學(xué)顯微鏡、點(diǎn)陣照明和激光掃描顯微鏡(如共焦顯微鏡和雙光子顯微鏡)。其中，激光掃描顯微鏡利用轉(zhuǎn)盤可以進(jìn)行多焦點(diǎn)激光掃描，提高了時(shí)間分辨率，有利于減少活細(xì)胞成像中的光損傷。本文主要實(shí)現(xiàn)可見光雙光子激發(fā)和多焦點(diǎn)激光掃描的結(jié)合，**終提高三維延遲掃描中的空間分辨率和成像對(duì)比度，這也是可見光雙光子激發(fā)(v2PE)在超高分辨率顯微鏡中的應(yīng)用。雙光子顯微鏡在多個(gè)領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例。國(guó)外ultimainvestigator雙光子顯微鏡光子躍遷

相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢(shì)呢？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來(lái)，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)、***觀察！由于電磁波的波長(zhǎng)越短，粒子性越強(qiáng)，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長(zhǎng)波長(zhǎng)激光，在增加了激光的穿透性的同時(shí)還減少了對(duì)細(xì)胞的毒性。除此之外，因?yàn)橹挥形镧R焦點(diǎn)處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點(diǎn)之外的熒光物質(zhì)消耗。國(guó)外ultimainvestigator雙光子顯微鏡光子躍遷這種雙光子顯微鏡的視場(chǎng)是普通顯微鏡的10倍。

其實(shí)電子顯微鏡相比光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢(shì)或意義不在于放大倍數(shù)，而在于超高的分辨率。這兩者是不同的。一般來(lái)說(shuō)，觀察時(shí)，除了放大物體外，還需要將其與其他相鄰物體區(qū)分開來(lái)。如果兩個(gè)相鄰粒子的圖像在光學(xué)顯微鏡下，即使放大很大程度，也可能看到兩個(gè)相交的亮點(diǎn)(艾里斑)，沒(méi)有明顯的邊界(更不用說(shuō)細(xì)節(jié)了)，說(shuō)明分辨率不夠。沒(méi)有分辨率談放大是沒(méi)有意義的。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限，大約是光波波長(zhǎng)的一半。通常稱之為光學(xué)顯微鏡的放大極限，但準(zhǔn)確的說(shuō)應(yīng)該叫分辨率極限。原因是光的衍射，根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實(shí)驗(yàn)證明了電子的波動(dòng)性，所以在電子顯微鏡中用電子代替光是可能的。電子顯微鏡也有很多種，被攝體像REM。也有根據(jù)衍射規(guī)律觀察的電子顯微鏡，如低能電子衍射(LEED)和透射電子顯微鏡(TEM)。兩者主要用于觀察晶體，根據(jù)晶體的周期特性在倒易空間產(chǎn)生衍射像，借助埃爾沃德球或傅里葉變換將其變換到實(shí)空間，即可得到真實(shí)的晶體表面像。

目前，腦科學(xué)的研究在全球范圍內(nèi)如火如荼，中國(guó)的腦計(jì)劃也即將啟動(dòng)。其中，全景式分析腦連接圖和功能動(dòng)態(tài)圖的研究成為重點(diǎn)研究方向，如何打破尺度壁壘，將微觀神經(jīng)元和突觸的信息處理和個(gè)體行為信息與全腦融合，是該領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。2021年1月6日，由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所牽頭，北京大學(xué)信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院電子系、工程學(xué)院和中國(guó)人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成的跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)在NatureMethods上在線發(fā)表了一篇題為《大視場(chǎng)、多平面、長(zhǎng)程腦成像的微型雙光子拷貝》的文章。本文報(bào)道了第二代小型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0。其成像視場(chǎng)是團(tuán)隊(duì)2017年發(fā)布的第1代小型化顯微鏡的7.8倍。同時(shí)具有三維成像能力，獲得了小鼠自由運(yùn)動(dòng)行為時(shí)大腦三維區(qū)域數(shù)千個(gè)神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)功能圖像，實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一批次神經(jīng)元一個(gè)月的跟蹤記錄。雙光子顯微鏡還可以對(duì)一些具有雙光子特性的染料細(xì)胞進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn)；

雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢(shì)在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域；因信號(hào)背景比高，而具有更高的對(duì)比度；因激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì)。國(guó)內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡成像原理是什么

由于其非侵入性和高分辨率的特點(diǎn)，雙光子顯微鏡成為了研究神經(jīng)科學(xué)、ai癥研究、免疫學(xué)等領(lǐng)域的重要工具。國(guó)外ultimainvestigator雙光子顯微鏡光子躍遷

王愛(ài)民副教授結(jié)合工作實(shí)例，展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應(yīng)用。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，重量只為2.2克，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過(guò)程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)清晰、穩(wěn)定的圖像，該顯微鏡適于佩戴在小動(dòng)物頭部，可實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動(dòng)態(tài)信號(hào)，在大型動(dòng)物上，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景，首先雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像，在亞微米級(jí)成像，此功能與目前市場(chǎng)上的共聚焦類顯微鏡性能類似；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r(shí)、在體、原位、無(wú)創(chuàng)地，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性，區(qū)分成像；雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行生化指標(biāo)成像，在無(wú)造影劑的前提下，利用自發(fā)熒光、二次諧波、熒光獲得活細(xì)胞生化信息。國(guó)外ultimainvestigator雙光子顯微鏡光子躍遷