當激光光束焦點的位置在鏡面上，此時被反射的激光在無限空間中成為準直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一個激光光斑。同理，如果橫向掃描光束，則會形成遠離傾斜鏡鏡面的焦點，這又導致返回的光束會聚或發(fā)散，進而OBJ2能在軸向不同位置形成焦點，通過這種方式即能實現連續(xù)的軸向掃描。對于較小的傾斜角，聚焦沒有球差。該組在實驗中表征了這種將橫向掃描轉換為軸向掃描技術的光學性能，并使用它將光片顯微鏡的成像速度提升了一個數量級，從而可以在三個維度上量化快速的囊泡動力學。該組還演示了使用雙光子光柵掃描顯微鏡以12kHz進行共振遠程聚焦，該技術可對大腦組織和斑馬魚心臟動力學進行快速成像，并具有衍射極限的分辨率。多光子顯微鏡涉及醫(yī)學、生物學、化學、物理學、電子學、工程學等學科，生產工藝相對復雜，進入門檻較高。熒光多光子顯微鏡設備

多束掃描技術可以同時對神經元組織的不同位置進行成像對兩個遠距離（相距大于1-2mm）的成像部位，通常使用兩條單獨的路徑進行成像；對于相鄰區(qū)域，通常使用單個物鏡的多光束進行成像。多光束掃描技術必須特別注意激發(fā)光束之間的串擾問題，這個問題可以通過事后光源分離方法或時空復用方法來解決。事后光源分離方法指的是用算法來分離光束消除串擾；時空復用方法指的是同時使用多個激發(fā)光束，每個光束的脈沖在時間上延遲，這樣就可以暫時分離被不同光束激發(fā)的單個熒光信號。引入越多路光束就可以對越多的神經元進行成像，但是多路光束會導致熒光衰減時間的重疊增加，從而限制了區(qū)分信號源的能力；并且多路復用對電子設備的工作速率有很高的要求；大量的光束也需要更高的激光功率來維持近似單光束的信噪比，這會容易導致組織損傷。熒光多光子顯微鏡設備雙光子顯微鏡可以在保持細胞活性的情況下進行成像，這對于研究細胞生理學和生物化學過程非常有用。

對于兩個遠距離(相距1-2mm以上)的成像部位，通常采用兩個**的路徑進行成像；對于相鄰區(qū)域，通常使用單個物鏡的多個光束進行成像。多光束掃描技術必須特別注意激發(fā)光束之間的串擾，這可以通過事后光源分離或時空復用來解決。事后光源分離法是指分離光束以消除串擾的算法；時空復用法是指同時使用多個激發(fā)光束，每個光束的脈沖在時間上被延遲，使不同光束激發(fā)的單個熒光信號可以暫時分離。引入的光束越多，可以成像的神經元越多，但多束會導致熒光衰減時間重疊增加，從而限制了分辨信號源的能力；并且復用對電子設備的工作速度要求很高；大量的光束也需要較高的激光功率來維持單束的信噪比，這樣容易導致組織損傷。

對于雙光子(2P)成像，散焦和近表面熒光激發(fā)是兩個相對較大的深度限制因素，而對于三光子(3P)成像，這兩個問題**減少。然而，由于熒光團的吸收截面遠小于2P，三光子成像需要更高的脈沖能量才能獲得與2P相同激發(fā)強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結構性3P顯微鏡要求更高，后者需要更快的掃描速度以便及時采樣神經元活動。為了在每個像素的停留時間內收集足夠的信號，需要更高的脈沖能量。復雜的行為通常涉及大規(guī)模的大腦神經網絡，這些網絡既有本地連接，也有遠程連接。為了將神經元的活動與行為聯系起來，需要同時監(jiān)測***分布的超大型神經元的活動。大腦中的神經網絡將在幾十毫秒內處理輸入的刺激。為了理解這種快速神經元動力學，MPM需要快速成像神經元的能力。快速MPM方法可分為單束掃描技術和多束掃描技術。目前中國顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等。

單光子激發(fā)熒光的過程，就是熒光分子吸收一個光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后，能量較大的激發(fā)態(tài)分子，通過內轉換把部分能量轉移給周圍的分子，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級的分子的平均壽命大約在10s左右。這時它不是通過內轉換的方式來消耗能量，回到基態(tài)，而是通過發(fā)射出相應的光量子來釋放能量，回到基態(tài)的各個不同的振動能級時，就發(fā)射熒光。因為在發(fā)射熒光以前已經有一部分能量被消耗，所以發(fā)射的熒光的能量要比吸收的能量小，也就是熒光的特征波長要比吸收的特征波長來的長。多光子顯微鏡的發(fā)展現狀及未來發(fā)展趨勢。共聚焦多光子顯微鏡供應商

多光子顯微鏡技術是對完整組織進行深層熒光成像的優(yōu)先技術。熒光多光子顯微鏡設備

在多光子顯微鏡（也稱為非線性或雙光子顯微鏡）中，以兩倍正常激發(fā)波長照射樣品。更長的波長是有利的，因為它們可以更深地穿透樣品進行3D成像，并且因為它們不會損壞樣品，從而延長樣品壽命。為了實現多光子激發(fā)，照明光束在空間上聚焦（使用光學器件），同時使用高能短脈沖激發(fā)光束以提高兩個（或更多）光子同時到達同一位置（即熒光團分子）的概率。多光子顯微技術的例子包括二次諧波產生(SHG)、三次諧波產生(THG)、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)和受激發(fā)射耗盡(STED)顯微技術。由于這些技術中的每一種都使用脈沖激光器，因此選擇能夠比較大限度地減少脈沖色散的光學組件很重要，并且激光反射二向色鏡應具有低GDD特性。熒光多光子顯微鏡設備