從雙光子的原理和特點(diǎn)，我們可以清楚地得出雙光子的優(yōu)點(diǎn):☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡采用可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，因此該波段的光對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷很小，適合長(zhǎng)期研究；☆穿透能力強(qiáng):與紫外光相比，可見光和近紅外光的穿透能力更強(qiáng)，因此受生物組織散射的影響更小，解決了生物組織深層物質(zhì)的層析成像問題；☆高分辨率:由于雙光子吸收的截面很小，只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā)熒光，雙光子吸收被限制在焦點(diǎn)處體積約為波長(zhǎng)三次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域小:由于激發(fā)只存在于交點(diǎn)處，焦點(diǎn)外的區(qū)域不會(huì)發(fā)生光漂白；☆熒光收集率高:與共焦成像相比，雙光子成像不需要濾光片(共焦)，提高了熒光收集率，直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高；☆圖像對(duì)比度高:由于熒光波長(zhǎng)小于入射波長(zhǎng)，瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲*為單光子激發(fā)產(chǎn)生的1/16，減少了散射的干擾；光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇性激發(fā)，因此可以用來對(duì)生物組織中的一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像；雙光子顯微鏡明日之星--FemtoFiber ultra 920 。熒光雙光子顯微鏡光毒性

在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測(cè)器測(cè)量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波光子激發(fā)熒光。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢(shì)：雙光子比共聚焦使用的更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā)，所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。ultimainvestigator雙光子顯微鏡商家雙光子顯微鏡角膜成像。

雙光子顯微鏡的應(yīng)用由于適合動(dòng)態(tài)成像，雙光子顯微鏡一經(jīng)問世便很快應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)、遺傳發(fā)育、藥物代謝等領(lǐng)域。雙光子顯微鏡能夠在細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞水平上對(duì)***神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分子相互作用等進(jìn)行直接成像監(jiān)測(cè)，而且能夠進(jìn)行光裂解、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱。同時(shí)，雙光子顯微鏡能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)**在體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并可對(duì)**治療過程中*細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估。隨著光學(xué)技術(shù)、熒光探針技術(shù)、計(jì)算機(jī)成像技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微技術(shù)會(huì)得到更大提升和更廣的應(yīng)用，未來不僅用于基礎(chǔ)研究，也將擴(kuò)展到臨床應(yīng)用。

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。深要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問題，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬(wàn)億分之一秒，而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫，這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細(xì)胞，使掃描能更好地進(jìn)行。雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無須使用孔限制光學(xué)散射。

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí)，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，從而被光探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì)。熒光雙光子顯微鏡光毒性

雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例。熒光雙光子顯微鏡光毒性

雙光子顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光子，經(jīng)過短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后，發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；效果和用波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優(yōu)點(diǎn)是具有更深的組織穿透深度，紅外光可以在平面上探測(cè)到極限為1mm的組織區(qū)域；因?yàn)樾盘?hào)背景比高，所以具有更高的對(duì)比度；由于激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)、光毒性小的特點(diǎn)；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，更加安全。熒光雙光子顯微鏡光毒性