雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有100飛秒，而其周期可以達(dá)到80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測(cè)效率。雙光子顯微鏡結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡。國(guó)內(nèi)investigator雙光子顯微鏡圖像對(duì)比度

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí)，經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過(guò)物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過(guò)物鏡，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。雙光子顯微鏡廠家電話雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例。

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過(guò)程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過(guò)程，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說(shuō)明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過(guò)激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測(cè)器測(cè)量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過(guò)單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過(guò)幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對(duì)比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢(shì)：雙光子比共聚焦使用的更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過(guò)1毫米。另外，同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā)，所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子技術(shù)和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡。

在國(guó)家自然科學(xué)基金委國(guó)家重大科研儀器研制專項(xiàng)《超高時(shí)空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下，北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所、信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院、動(dòng)態(tài)成像中心、生命科學(xué)學(xué)院、工學(xué)院聯(lián)合中國(guó)人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)，歷經(jīng)三年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，并獲取了小鼠在自由行為過(guò)程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)清晰、穩(wěn)定的圖像。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊NatureMethods(IF25.3)，并已申請(qǐng)多項(xiàng)。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用。進(jìn)口ultima雙光子顯微鏡的成像視野

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?國(guó)內(nèi)investigator雙光子顯微鏡圖像對(duì)比度

基因編碼的熒光探針可用于在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測(cè)體內(nèi)神經(jīng)元信號(hào)，這是揭示動(dòng)物神經(jīng)活動(dòng)復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵。雙光子顯微鏡(2PM)可以對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進(jìn)行亞細(xì)胞分辨率的成像，從而測(cè)量不透明腦深部的活動(dòng)。成像膜的電壓變化可以直接反映神經(jīng)元的活動(dòng)，但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來(lái)說(shuō)太快了。目前，電壓成像主要由寬視場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn)，但其空間分辨率較差，且只能在淺深度成像。因此，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化，需要將成像速率提高2PM。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時(shí)間延遲的聚焦陣列。然后，該模塊被集成到一個(gè)帶有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是重復(fù)頻率為1MHz的920nm激光器。FACED模塊可以產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像。虛光源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡，從而在X軸上產(chǎn)生0.82m和0.35m的橫向分辨率。國(guó)內(nèi)investigator雙光子顯微鏡圖像對(duì)比度