對于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經(jīng)元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號。復雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學，就需要MPM具備對神經(jīng)元進行快速成像的能力?？焖費PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。高速掃描，高分辨率，多光子顯微鏡助力科研進步。嚙齒類多光子顯微鏡成像深度

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學切片和深層成像等功能，這兩個優(yōu)勢極大地促進了研究者們對于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認識。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動與復雜行為聯(lián)系起來，通常需要對大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強度來解決散射問題，但這會帶來其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光。高速高分辨率多光子顯微鏡代理商多光子顯微鏡，突破光學成像技術(shù)極限，開啟生命科學新紀元。

ＳｔｅｒｎａｎｄＪｅａｎＭａｒｘ在評論中說：祖家能夠在更為精細的層次研究樹突的功能，這在以前是完全不可能的。新的技術(shù)（如腦片的膜片鉗和雙光子顯微使人們對樹突的計算和神經(jīng)信號處理中的作用有了更好的理解。他們解釋了是樹突模式和形狀多樣性，及其獨特的電、及其獨特的電化學特征使神經(jīng)元完成了一系列的專門任務(wù)。雙光子與共聚焦在發(fā)育生物學中的應(yīng)用雙光子∶每2.5分鐘掃描一次，觀察24小時，發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦∶每15分鐘掃描一次，觀察8小時后細胞分裂停止，不能發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦激發(fā)時的細胞存活率為多光子系統(tǒng)的10～20%。

在生物成像中，我司多光子顯微鏡具有清晰，快速，深層，活這四個方面。結(jié)合了多光子上轉(zhuǎn)化材料以及時間編碼的結(jié)構(gòu)光超分辨技術(shù)，實現(xiàn)了快速（50MHz的掃描速度），超分辨（超衍射極限）成像。作為一種新的高速，超高分辨率的成像系統(tǒng)，MUTE-SIM可以幫助我們對快速運動的生物圖像進行分辨率高的成像。盡管關(guān)于深度成像的應(yīng)用我們沒有進一步展示，但是結(jié)合1560nm近紅外光相對于可見光更佳的穿透性，我們相信該技術(shù)將有利于對生物組織進行高速，超分辨，高深度地成像，有助于生物影像學的發(fā)展。滔博生物TOP-Bright是一家集研發(fā)，生產(chǎn)，銷售于一體的專注于神經(jīng)科學產(chǎn)品及致力于向高校、科研機構(gòu)等領(lǐng)域提供實驗室一體化方案的高科技企業(yè)。業(yè)務(wù)服務(wù)范圍已遍布至全國各地幾百家實驗室。目前公司主營產(chǎn)品是享譽全球的國際品牌和產(chǎn)品,這些儀器設(shè)備都是科學研究所必備且不可替代的基礎(chǔ)儀器。利用多光子顯微鏡，進行組織內(nèi)深層結(jié)構(gòu)的無損成像。

快速光柵掃描有多種實現(xiàn)方式，使用振鏡進行快速2D掃描，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進行快速3D掃描，但可調(diào)電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替。遠程聚焦也是一種實現(xiàn)3D成像的手段。在LSU模塊中，掃描振鏡進行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調(diào)控M的位置實現(xiàn)軸向掃描。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計來擴大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無法快速移動以進行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠程聚焦、SLM和可調(diào)電動透鏡。多光子顯微鏡技術(shù)的優(yōu)勢如何？又有哪些應(yīng)用？美國模塊化多光子顯微鏡方案

多光子顯微鏡的發(fā)展現(xiàn)狀及未來發(fā)展趨勢。嚙齒類多光子顯微鏡成像深度

多光子激發(fā)的特點。激發(fā)波長∶兩個或多個光子同時激發(fā)，激發(fā)波長是單光子激發(fā)波長的兩倍或多倍（i.e.紅光能激發(fā)UV探針）。多光子激發(fā)∶依賴于多個光子同時到達的時間。使用脈沖飛秒激光器（i.e.10-16seconds），且能提供更高的峰值功率。熒光限制在焦點處，能滿足多個光子同時達到產(chǎn)生多光子吸收。熒光強度正比于（激光強度）n。為什么使用飛秒激光器?多光子激發(fā)需要超快的激光器，皮秒脈沖不能實現(xiàn)三光子激發(fā)。深度成像需要更高、更窄脈沖輸出功率。多光子激發(fā)光源處于近紅外區(qū)，對細胞毒性和光漂白更小。嚙齒類多光子顯微鏡成像深度