雙光子顯微鏡是一種先進的成像技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)細胞或組織的深層觀察。它的主要特點是使用雙光子激發(fā)來產(chǎn)生熒光，從而實現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像。雙光子顯微鏡的工作原理是利用激光的脈沖寬度極窄的特性，將高能激光束聚焦到生物樣品中，激發(fā)出熒光。這個過程需要使用一個特殊的雙光子激發(fā)源，它能夠?qū)⒁粋€光子轉(zhuǎn)換為兩個光子，其中一個光子用于激發(fā)熒光，另一個光子則用于成像。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點：高分辨率：由于雙光子激發(fā)的特性，可以實現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像，特別是對于深層組織的觀察。穿透深度大：雙光子激光的波長較長，能夠更好地穿透生物組織，從而實現(xiàn)對深層細胞的觀察。熒光壽命長：雙光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命比單光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命長，這使得雙光子顯微鏡能夠更好地區(qū)分不同的熒光標記物。減少光毒性：由于雙光子激發(fā)的能量較低，因此對生物樣品的損傷較小，可以減少光毒性?？傊?，雙光子顯微鏡是一種非常有用的成像技術(shù)，可以用于生物學、醫(yī)學、材料科學等領(lǐng)域的研究。雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的；國內(nèi)熒光雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

為了驗證動物生物樣品的時間分辨成像能力，本實驗觀察了活海拉細胞高爾基體中的青色熒光蛋白mTFP1，見圖3(a),(c)-(i)。使用的物鏡及尺寸與熒光顆粒成像一致，對比可見v2PE在空間分辨率、激發(fā)深度級圖像對比度較常規(guī)寬場顯微鏡都有所提高。此外，v2PE可以同時激發(fā)多個波長的熒光蛋白，這種技術(shù)還可以應(yīng)用于細胞內(nèi)分子的三維動力學多色成像。在此基礎(chǔ)上，實驗對海拉細胞中的高爾基體(mTFP1)和纖顫蛋白(EGFP)進行了在體成像，見圖3(j)-(n)，青色為mTFP1,綠色為EGFP，實驗中兩種熒光蛋白同時成像，終采用光譜分離法將不同蛋白的熒光信號分離出來。美國激光熒光雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)雙光子顯微鏡使用方法是什么？

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域小：由于激發(fā)只存在于交點處，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學濾波器（共焦），這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高。

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學和材料科學中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子過期后，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上。即便如此，世界上很多實驗室都搭雙光子，自己搭的好處有很多，首先是便宜，尤其是實驗室已經(jīng)有飛秒激光器，那就更很省錢了。其次是靈活，可以選擇針對特殊用途的搭配，改動也靈活。好處就是可以鍛煉隊伍，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護也更加自由。當然壞處也不少，首先是操心，特別是第1次搭的時候，開始要想方案，后來要解決各種實際問題。其次是花時間，加上買配件的時間，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol，大多是老外寫的，中文的較少。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的，尤其是沒有經(jīng)驗的時候，容易走彎路，多花錢，也多花時間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買，在國內(nèi)買這些東西耗時較長。因此，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗，貼出來分享，希望能幫到想自己動手的實驗室，雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被發(fā)動，所以雙光子成像更清晰。

雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。微型雙光子顯微鏡的優(yōu)勢是。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡的原理

雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。國內(nèi)熒光雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強？生物組織在近紅外波段存在兩個窗口,第1個近紅外窗口對應(yīng)波長在700nm-900nm,第2個近紅外窗口對應(yīng)波長在1000nm-1400nm之間。舉例說明就是單晶硅對于可見光幾乎是不透明的，但是對于紅外波段就像是“水晶”一樣通透性很好了。原因有兩點：1.生物組織對紅外光的吸收弱，對可見光吸收強。類似的，平時用手電筒照射手指，會看到手通透紅亮，也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少。2.生物組織對紅外光的散射弱。因為瑞利散射的強度反比于波長λ的四次方。類似的，早晨的太陽非常紅，也就是因為長波長的紅光穿透力更強。這兩點共同導致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強。國內(nèi)熒光雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么