雙光子顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新技術。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外、可見光調整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。雙光子顯微鏡角膜成像。國外布魯克雙光子顯微鏡作用

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢？它能做到什么普通光學顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、觀察！由于電磁波的波長越短，粒子性越強，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性。除此之外，因為只有物鏡焦點處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點之外的熒光物質消耗。國外ultima雙光子顯微鏡用途上海雙光子顯微鏡就找因斯蔻浦。

雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術相結合的新技術。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子，經過短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后，發(fā)射一個波長較短的光子；效果和用波長為長波長一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優(yōu)點是具有更深的組織穿透深度，紅外光可以在平面上探測到極限為1mm的組織區(qū)域；因為信號背景比高，所以具有更高的對比度；由于激發(fā)體積小，具有定點激發(fā)、光毒性小的特點；激發(fā)波長由紫外、可見光調整為紅外激發(fā)，更加安全。

    其實電子顯微鏡相比于光學顯微鏡的重要優(yōu)勢或者存在的比較大意義，準確的來說，不在于放大倍數，而在于超高的分辨率。這兩者是不同的。通俗的來說，就是進行觀察的時候，除了要將物體放大，還需要能將它與相鄰的其他物體分辨開來。如果兩個相鄰微粒的圖像在光學顯微鏡下，即使放大到很大，看到的可能卻是兩個相交的亮斑（艾里斑），而沒有明顯的界限（更不用說細節(jié)了），這表示是分辨率不夠。拋開分辨率談放大倍數是沒有意義的。光學顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限，約等于光波波長的一半，通常被說成是光學顯微鏡放大極限，其實準確地來說，應該叫做分辨率的極限。而其產生的原因是光的衍射，根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實驗證明了電子的波動性，于是用電子代替光的電子顯微鏡成為可能。電子顯微鏡也有多種，題主說的是像REM的。電鏡也存在用衍射規(guī)則觀察的，比如低能電子衍射（LEED）和透射電鏡（TEM）。兩者主要用于觀察晶體，根據其周期性的特點而生成倒易空間里的衍射圖像，借助elward球或者傅里葉變換就可以轉換到實空間，得到真正的晶體表面圖像了。 雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被發(fā)動，所以雙光子成像更清晰。

單光子顯微技術是成熟的熒光顯微技術，但由于其使用的激發(fā)光波長較短，成像深度有限；能量較大,會造成對熒光物質的漂白,光毒性嚴重。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實現樣本三維成像要逐點掃描,成像速度慢,對樣本損害大,很難用于長時間活細胞成像。而寬場顯微鏡能夠很好地實現實時動態(tài)成像,光漂白小,因而較早應用于活細胞內的實時檢測，但寬場顯微鏡由于離焦信號的干擾,難以實現多維成像。雙光子熒光顯微鏡（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。雙光子顯微成像技術是近些年發(fā)展起來的結合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新型非線性光學成像方法,采用長波激發(fā)，能對組織進行深層次成像。常用的比較好激發(fā)波長大多位于800-900nm，而水、血液和固有組織發(fā)色團對這個波段的光吸收率低，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品，因此背景第，光損傷小，適用于在體檢測。雙光子熒光成像技術能準確定位細胞內置入的微電極位置，從而觀察胞體、樹突甚至單個樹突棘的活性。研究者可完整的觀察神經組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經細胞單個樹突棘中的鈣分布。雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。國外布魯克雙光子顯微鏡作用

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1990年初，當WinfriedDenk剛從康奈爾大學博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時，他看了一本關于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學效應——強光和物質的相互作用。當時，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個紫外光子激發(fā)標記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯合他的導師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數據則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。國外布魯克雙光子顯微鏡作用