使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測體內(nèi)神經(jīng)元信號，這是揭示動物神經(jīng)活動復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實(shí)現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進(jìn)行成像，需要明顯提高2PM的成像速率。全球多光子顯微鏡主要廠商基本情況介紹，包括公司簡介、多光子顯微鏡產(chǎn)品型號、產(chǎn)量、產(chǎn)值及動態(tài)等。美國激光掃描多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)

某種物質(zhì)能產(chǎn)生熒光，首要條件是分子必須具有吸收的結(jié)構(gòu)，即生色團(tuán)（分子中具有吸收特征頻率的光能的基團(tuán)）。其次，該物質(zhì)必須具有一定的量子產(chǎn)率和適宣的環(huán)境。我們把分子中發(fā)射熒光的基團(tuán)稱為熒光團(tuán)。熒光團(tuán)一定是生色團(tuán)，但生色團(tuán)不一定是熒光團(tuán)。因?yàn)?，如果生色團(tuán)的量子產(chǎn)率等于零，就不能發(fā)射出熒光，處于激發(fā)態(tài)的分子，可以由許多方式（如熱，碰撞）把能量釋放出來，發(fā)射熒光只是其中的一種方式。此外，一種物質(zhì)吸收光的能力及量子產(chǎn)率又與物質(zhì)所處的環(huán)境密切相關(guān)。清醒動物多光子顯微鏡配置4tune光譜檢測器，實(shí)現(xiàn)多光子顯微鏡的光譜型檢測。

    與傳統(tǒng)的單光子寬場熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡(MPM)具有光學(xué)切片和深度成像的功能，極大地促進(jìn)了研究人員對整個大腦深部神經(jīng)的認(rèn)識。2019年，JeromeLecoq等從腦深部神經(jīng)元成像、大數(shù)量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像三個方面討論了相關(guān)的MPM技術(shù)。為了將神經(jīng)元活動與復(fù)雜行為聯(lián)系起來，通常需要對大腦皮層深處的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具備深度成像的能力。激發(fā)光和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收，這是限制MPM成像深度的主要因素。雖然增加激光強(qiáng)度可以解決散射問題，但會帶來其他問題，如燒焦樣品、散焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度的比較好方法是使用更長的波長作為激發(fā)光。另外，對于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號。

    繼首代小型化雙光子顯微鏡在國際上獲得小鼠自由行為過程中大腦神經(jīng)元和突觸的動態(tài)圖像后，我們成功研制了第二代小型化雙光子顯微鏡。它具有更大的成像視野和三維成像能力，可以清晰穩(wěn)定地對自由活動小鼠三維腦區(qū)的數(shù)千個神經(jīng)元進(jìn)行成像，實(shí)現(xiàn)對同一批神經(jīng)元的一個月追蹤記錄。通過對微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計(jì)系統(tǒng)的。微物鏡工作距離延長至1mm，實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)成像。內(nèi)嵌可拆卸的快速軸向掃描模塊，可采集深度180微米的3D體成像和多平面快速切換的實(shí)時成像。該掃描模塊由一個快速的電動變焦透鏡和一對中繼透鏡組成，在不同深度成像時可保持放大倍率恒定。其變焦模塊重量，研究人員可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探頭可整體即時拔插，極大地簡化了實(shí)驗(yàn)操作，避免了長周期實(shí)驗(yàn)時對動物的干擾。在重復(fù)裝卸探頭同一批神經(jīng)元時，視場旋轉(zhuǎn)角小于，邊界偏差小于35微米。 多光子顯微鏡將生物打印結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位和定向到特定的解剖部位，使其能夠在小鼠組織內(nèi)制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)。

細(xì)胞在受到外界刺激時，隨著刺激時間的增長，即使刺激繼續(xù)存在，Ca2+熒光信號不但不會繼續(xù)增強(qiáng)，反而會減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時的水平。對于細(xì)胞受精過程中 Ca2+熒光信號的變化情況，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過程中，Ca2+熒光信號未發(fā)生任何變化，而配子之間發(fā)生融合作用時，Ca2+熒光信號強(qiáng)度卻會出現(xiàn)一個不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象，對研究受精發(fā)育的早期信號及 Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等，Ca2+熒光信號強(qiáng)度也會發(fā)生很的變化。多光子顯微鏡能提供多種對比度機(jī)制。美國共聚焦多光子顯微鏡數(shù)據(jù)采集

利用多光子顯微鏡的光遺傳學(xué)操作能力，我們可以對某類神經(jīng)元的ji活和失活進(jìn)行高精度的操作。美國激光掃描多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)

Ca2+是重要的第二信使，對于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)具有重要的作用，開發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對Ca2+熒光信號進(jìn)行觀測，可以從某些方面對有機(jī)體或細(xì)胞的變化機(jī)制進(jìn)行分析，具有重要的意義。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細(xì)胞內(nèi)用熒光探針標(biāo)記的 Ca2*的時間和空間的熒光圖像的變化，還可以觀察細(xì)胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化。通過對單細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+不僅在細(xì)胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的，而且細(xì)胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的 Ca2+梯差即所謂的空間 Ca2梯差。美國激光掃描多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)