為了驗證動物生物樣品的時間分辨成像能力，本實驗觀察了活海拉細胞高爾基體中的青色熒光蛋白mTFP1，見圖3(a),(c)-(i)。使用的物鏡及尺寸與熒光顆粒成像一致，對比可見v2PE在空間分辨率、激發(fā)深度級圖像對比度較常規(guī)寬場顯微鏡都有所提高。此外，v2PE可以同時激發(fā)多個波長的熒光蛋白，這種技術(shù)還可以應(yīng)用于細胞內(nèi)分子的三維動力學(xué)多色成像。在此基礎(chǔ)上，實驗對海拉細胞中的高爾基體(mTFP1)和纖顫蛋白(EGFP)進行了在體成像，見圖3(j)-(n)，青色為mTFP1,綠色為EGFP，實驗中兩種熒光蛋白同時成像，終采用光譜分離法將不同蛋白的熒光信號分離出來。雙光子顯微鏡的應(yīng)用中，該如何選擇以及更好的使用PMT。進口bruker雙光子顯微鏡

指示劑是如何負載細胞，目前有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法，且都可以用于體內(nèi)和體外研究。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個神經(jīng)元中。此方法方便實驗者控制單個神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負載神經(jīng)元，觀察對象為一群神經(jīng)元。盡管此方法可能導(dǎo)致一些膠質(zhì)細胞也被指示劑所標(biāo)記，但明顯提高了整體神經(jīng)元的標(biāo)記百分比，使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動作電位相關(guān)性的活動。第三種也較為常用，通過病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑。（A）單細胞注射法；（B）networkloading法；（C）通過病毒轉(zhuǎn)染使其基因編碼鈣離子指示劑（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）進口布魯克雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細胞進行特定實驗；

在該自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡中，她們將空間光位相調(diào)制器光學(xué)共軛到顯微物鏡的后焦平面，通過位相調(diào)制器將入射光分成若干子區(qū)域，每一塊子區(qū)域的波前都可以被控制。同時，她們用數(shù)字微陣列光處理器，以不同的頻率同時調(diào)制其中一半子區(qū)域的入射光強度，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”。來自所有子區(qū)域光束會在焦點處會聚干涉，通過監(jiān)測焦點激發(fā)的雙光子信號隨時間的變化情況，并進行傅里葉變換分析，可以“分解”得到被調(diào)制的每一塊子區(qū)域的“光線”的貢獻信息，從而可以實現(xiàn)對一半子區(qū)域波前的并行測量。對另一半子區(qū)域重復(fù)這一測量過程，從而獲得整個入射波前的信息并進行校正。該方法耗時很短，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正，無需復(fù)雜的計算，適用于任何標(biāo)記密度和標(biāo)記類型的樣品。更重要的是，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內(nèi)的成像質(zhì)量。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物、醫(yī)學(xué)問題提供了可行性方案。

美國霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所在Janelia Farm ResearchCampus的吉娜博士小組與來自中科院上海光機所強場激光物理國家重點實驗室的王琛博士較近成功將一種新的自適應(yīng)光學(xué)的方法和雙光子顯微鏡結(jié)合，研制出一種新的自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡。通過校正小鼠大腦的像差，在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數(shù)倍的成像分辨率和信號強度，明顯改進了成像質(zhì)量，使得原來在鼠腦中不可見或者模糊的細節(jié)變得清晰可見，她們成功將該方法應(yīng)用于老鼠視覺皮層第五層（約500μm）的形貌結(jié)構(gòu)成像和鈣離子功能成像。這一新的自適應(yīng)光學(xué)方法，使得在小鼠深層區(qū)域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現(xiàn)實。這一成果發(fā)表在較新一期的《Nature Methods》。雙光子顯微鏡廠家就找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司；

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。國內(nèi)ultimainvestigator雙光子顯微鏡的成像視野

雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的成像研究。進口bruker雙光子顯微鏡

和很多偉大的科學(xué)發(fā)明一樣，雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點偶然，但正是那瞬間的靈感為生物科學(xué)尤其是神經(jīng)科學(xué)帶來了一種**性的成像技術(shù)：雙光子激發(fā)熒光顯微鏡。1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學(xué)元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。進口bruker雙光子顯微鏡