來源：ZSCI基礎(chǔ)研究中如果加入動物實(shí)驗(yàn)部分則使得研究更加趨于完善，投稿時(shí)中稿率也相應(yīng)會增加。但將動物實(shí)驗(yàn)做好卻不是一件容易的事情。這篇文章主要講動物模型的構(gòu)建技術(shù)，把骨科、糖尿病相關(guān)的動物模型構(gòu)建做了一個(gè)***的技術(shù)匯總，建議先碼后讀，文章內(nèi)容有部分做了簡化，想看詳細(xì)講解可以在文末獲取課件！一、骨科相關(guān)動物模型1.骨關(guān)節(jié)炎1）骨關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建方法（誘發(fā)性）-關(guān)節(jié)腔內(nèi)手術(shù)法、關(guān)節(jié)腔注射法。2）模型評分標(biāo)準(zhǔn)①SafraninO染色與OARSI評分（PMID：31046827、30942801）②HE染色與OARSI評分（PMID：30609097）③SafraninO染色與Mankin評分（PMID：30609097）2.骨質(zhì)疏松癥1）骨關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建方法去趨法模型PMID：31037128實(shí)驗(yàn)動物：小鼠方法：在戊巴比妥麻醉下進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)以誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥，同時(shí)對照組小鼠*進(jìn)行卵巢外置但未切除。2）模型檢測指標(biāo)(PMID：31037128)①HE染色②Micro-CT③TRAcP染色④Micro-CT相關(guān)指標(biāo)檢測3.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性自身免疫性疾病狀態(tài)，其特征是滑膜增生，軟骨退化和脊椎關(guān)節(jié)的骨侵蝕4.強(qiáng)直性脊柱炎1）強(qiáng)直性脊柱炎模型構(gòu)建方法2）模型檢測指標(biāo)。人類疾病的動物模型是指各種醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中建立的具有人類疾病模擬表現(xiàn)的動物。普陀區(qū)視覺疾病動物模型建模

    具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對發(fā)明作進(jìn)一步闡述。本發(fā)明構(gòu)建了pirb基因敲入的小鼠動物模型，將pirb基因敲入c57bl/6j小鼠的rosa26基因的內(nèi)含子1內(nèi)。具體來說，構(gòu)建一個(gè)cagpromoter-loxp-stop-loxp-kozak-mousepirbcds-polya的基因盒，將其克隆進(jìn)入rosa26基因的內(nèi)含子1中。rosa26基因(ncbireferencesequence：)位于小鼠的七號染色體。本發(fā)明pirb基因敲入的小鼠動物模型的構(gòu)建方法，具體按照以下步驟具體實(shí)施:步驟1、根據(jù)小鼠rosa26基因(genebank：))序列，利用cas-desigher軟件在1號內(nèi)含子設(shè)計(jì)grna靶序列，并搜索小鼠dbm-db基因組數(shù)據(jù)庫基因，采用crispr脫靶效應(yīng)軟件cas-offinder檢測潛在的脫靶位點(diǎn)：**終選取兩個(gè)grna，grna1的基因序列如seqid**所示，grna2的基因序列如：seqid**:ggcaggcttaaaggctaacctgg將grna1和grna2分別與trancrrna在25℃孵育10min形成二級結(jié)構(gòu)；步驟2、利用c57bl/6小鼠文庫bac克隆，通過pcr擴(kuò)增獲得pirb基因cds的同源臂，采用in-fusion方法構(gòu)建含有cagpromoter-loxp-stop-loxp-kozak-mousepirbcds-polya的基因盒的質(zhì)粒打靶載體，通過酶切、pcr及測序?qū)Υ虬匈|(zhì)粒載體進(jìn)行驗(yàn)證，圖1為構(gòu)建好的pirb基因打靶載體的示意圖。普陀區(qū)視覺疾病動物模型建模疾病動物模型建模有加些方式？

    即為本發(fā)明構(gòu)建的一種pirb基因敲入的小鼠動物模型。本發(fā)明所采用第二種技術(shù)方案的特點(diǎn)還在于，步驟1中得到grna1和grna2后分別與trancrrna在25℃孵育10min形成二級結(jié)構(gòu)。步驟3中g(shù)rna1、grna2的濃度均為2～10pmol/ul，cas9蛋白的注射濃度為30～100ng/μl。步驟4中southern雜交采用bamhi和avrii核酸內(nèi)切酶切割f1代雜合子小鼠的dna。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了pirb基因敲入的小鼠動物模型及其構(gòu)建方法，本發(fā)明的小鼠動物模型對于pirb基因功能的研究和在體驗(yàn)證提供了良好的基礎(chǔ)。分離自pirb基因敲入小鼠的細(xì)胞還可以用于研究pirb發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的下游機(jī)制。通過pirb敲入動物模型與不同類型cre小鼠的雜交，可以用于研究ad不同***或不同細(xì)胞類型pirb的調(diào)節(jié)作用。附圖說明圖1為本發(fā)明pirb基因敲入的小鼠插入pirb基因cds和loxp位點(diǎn)的打靶質(zhì)粒載體的構(gòu)建圖；圖2為本發(fā)明pirb基因敲入的小鼠模型的構(gòu)建方法的流程圖；圖3為本發(fā)明f1代pirb敲入的小鼠的基因型pcr結(jié)果鑒定電泳圖；圖4為本發(fā)明f1代pirb敲入的小鼠驗(yàn)證pirb基因敲入效果的測序峰圖；圖5為本發(fā)明f1代pirb基因敲入的小鼠進(jìn)行southern鑒定的方法示意圖；圖6為本發(fā)明f1代pirb基因敲入的小鼠進(jìn)行southern鑒定的結(jié)果圖。

    實(shí)驗(yàn)期間每天進(jìn)行陰道涂片，觀測動情周期變化。進(jìn)一步地，檢測***水平是指：檢測雌***(e2)、促卵泡生長素(fsh)和促黃體生成素(lh)的水平。進(jìn)一步地，檢測對比卵巢重量是指：比較各組大鼠雙側(cè)卵巢臟器系數(shù)。進(jìn)一步地，陰道涂片是指：采用陰道脫落細(xì)胞涂片法，使用染色劑為亞甲基藍(lán)。本發(fā)明利用順鉑成功地建立了大鼠卵巢早衰模型，為基礎(chǔ)研究建立穩(wěn)定的卵巢早衰動物模型奠定了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義。提及的術(shù)語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準(zhǔn)。附圖說明圖1：e2水平檢測結(jié)果示意圖。圖2：fsh水平檢測結(jié)果示意圖。圖3：lh水平檢測結(jié)果示意圖。圖4：大鼠體重檢測結(jié)果示意圖。圖5：大鼠卵巢重量統(tǒng)計(jì)示意圖。圖6：動情周期檢測(光鏡下10倍)示意圖，其中，a、b、c、d依次為：動情前期，動情期，動情后期，動情間期。圖7：he染色觀察不同方法造模對卵泡形態(tài)的影響(光鏡下10倍)示意圖，其中，a、b、c、d依次為：空白組，2mg組，4mg組，6mg組。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下。上海東寰告訴您如何選擇好的動物模型。

1、動物模型名稱：低鐵飼料聯(lián)合放血致缺鐵性貧血大鼠模型2、實(shí)驗(yàn)動物種屬：SD大鼠3、實(shí)驗(yàn)動物性別：雌性4、實(shí)驗(yàn)動物年齡：初斷乳5、實(shí)驗(yàn)動物體重：50~70g6、實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境：SPF級 1、實(shí)驗(yàn)方法：低鐵飼料聯(lián)合放血法誘導(dǎo)。SD大鼠每天給予低鐵飼料和超純水飼養(yǎng)，并每周通過眼底靜脈叢放血1mL，連續(xù)3周。2、檢測標(biāo)準(zhǔn)：血紅蛋白含量明顯下降，紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉明顯升高。1.提供動物模型構(gòu)建過程中的原始實(shí)驗(yàn)記錄及數(shù)據(jù)圖片。2.根據(jù)要求提供構(gòu)建成功的模型動物或相關(guān)組織材料。利用動物疾病模型來研究人類疾病可以克服平時(shí)一些不易見到不便于在病人身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的人類疾病的研究。徐州泌尿疾病動物模型建模

實(shí)驗(yàn)動物向小型化的發(fā)展趨勢更有利于實(shí)驗(yàn)者的日常管理和實(shí)驗(yàn)操作。普陀區(qū)視覺疾病動物模型建模

    該模型能夠幫助我們研究pirb基因在免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的功能以及下游的調(diào)節(jié)機(jī)制。本發(fā)明的另一目的在于提供上述小鼠動物模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明所采用的第一種技術(shù)方案是：pirb基因敲入的小鼠動物模型，包括確定pirb基因的待敲入的特異性靶位點(diǎn)grna1和grna2，將pirb基因敲入c57bl/6j小鼠的rosa26基因的內(nèi)含子1內(nèi)，所述grna1的基因序列如seqid**所示，grna2的基因序列如。本發(fā)明所采用的第二種技術(shù)方案為：pirb基因敲入的小鼠動物模型的構(gòu)建方法，具體按照以下步驟實(shí)施：步驟1、基于crispr/cas9技術(shù)構(gòu)建針對c57bl/6j小鼠rosa26基因的特異性grna1和grna2，grna1的基因序列如seqid**所示，grna2的基因序列如；步驟2、構(gòu)建“cagpromoter-loxp-stop-loxp-kozak-mousepirbcds-polya”基因盒打靶載體，將打靶載體進(jìn)行線性化處理；步驟3、步驟2中將含有l(wèi)oxp位點(diǎn)打靶載體、步驟1中有活性的grna1和grna2與cas9蛋白共同注射進(jìn)入**小鼠受精卵中，獲得f0代小鼠；步驟4、將步驟3中性成熟的陽性f0小鼠分別與野生型鼠交配繁一代，獲得f1代雜合子小鼠，通過pcr、測序和southern雜交確定動物基因型；步驟5、將步驟4獲得的f1代雜合子小鼠近交獲得f2代純合子小鼠。普陀區(qū)視覺疾病動物模型建模

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