LC-MS中級分析是一種被大眾接受的分析方法，用于快速表征mAb和其他基于IgG的生物制藥。它有助于理解多種關鍵質量屬性 （CQA），例如糖基化、氧化和 C 端賴氨酸剪切。這種關于翻譯后修飾（PTM）的詳細知識是生物制藥開發(fā)和制造所必需的。Genovis的FabRICATOR HPLC酶色譜柱，可快速進行單克隆抗體的柱上酶切，并產(chǎn)生一致的亞基。該色譜柱含有固定化的FabRICATOR（IdeS）酶，可在鉸鏈下方快速且特異性地消化IgG，產(chǎn)生F（ab'）2和Fc片段，而不會出現(xiàn)任何過度消化的風險。為了減少樣品處理并為樣品制備提供自動化解決方案，F(xiàn)abRICATOR被共價固定在樹脂上，并裝在適用于HPLC的PEEK色譜柱硬件中。使用FabRICATOR HPLC色譜柱，只需稍作修改，即可使用標準HPLC-MS裝置自動生成抗體亞基。然后，F(xiàn)abRICATOR HPLC色譜柱上消解產(chǎn)生的亞基被捕獲在在線連接的反相（RP）色譜柱的柱頭上?？捎糜谘芯刻囟‵c區(qū)域的質量屬性，有助于研究GS連接子的修飾。山東GingisREXIdeS蛋白酶抗體酶切

Genovis的FabRICATOR是一種半胱氨酸蛋白酶，它對許多不同的物種和IgG亞類都有活性，包括人IgG亞類1-4以及猴子、兔子、大鼠和綿羊IgG的一些亞類。FabRICATOR在鉸鏈下方的單個位點進行消化，生成F(ab’)2和Fc/2子基，可以進一步還原生成Fd’，輕鏈和F/2子基是必需的。FabRICATOR（IdeS）通過蛋白-蛋白相互作用與目標抗體工作，這說明了它的高特異性。事實上，它在單個位點消化意味著使用FabRICATOR時沒有過度消化的風險，其高特異性也意味著相同的消化方案可以作為平臺方法應用于許多不同的抗體。FabRICATOR（IdeS）不需要還原條件來獲得良好活性，也不需要任何額外的輔助因子，它將在不同生理緩沖中發(fā)揮作用。這意味著按照下面的鉸鏈消解，您將生成F(ab’)2和Fc/2片段用于分析或其他應用。浙江GlycINATORIdeS蛋白酶抗體酶切IgA2 亞類以三種等位基因形式存在，A2m1、A2m2 和 A2m3。

大多數(shù)zhiliao性抗體都攜帶人IgG1骨架，雙特異性和多特異性形式的開發(fā)正在迅速增加。此類抗體的分析需要特異性酶來表征特性，例如單價結合、二硫鍵擾亂和配對Fc糖基化。傳統(tǒng)方案包括使用木瓜蛋白酶和Lys-C的酶消化，這需要優(yōu)化以極大限度地減少過度消化并獲得足夠的產(chǎn)量。Genovis的FabDELLO與IdeS酶具有不同的特異性，它在鉸鏈上方的單個位點消化人IgG1，并產(chǎn)生完整的Fab和Fc片段。為了證明FabDELLO的特異性活性，通過非還原SDS-PAGE消化和分析了IgG1和Fc融合蛋白的選擇。所有底物均實現(xiàn)了完全消化，包括具有其他困難的LALA和LFLE突變的IgG1。FabDELLO酶在底物上的精確和有效性能驗證了其在生物制藥開發(fā)中的用途。

作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，IgA在自身免疫性疾病、過敏反應、胃腸道疾病等許多不同的健康狀況中發(fā)揮作用。在天然條件和復雜生物樣品中選擇性和特異性消化IgA的能力在臨床醫(yī)學和研究中具有重要價值。IgASAP酶是降低zhiliao性IgA候選物樣品復雜性并簡化IgA分析表征的寶貴工具。人IgA1和IgA2之間的一個顯著結構差異是鉸鏈區(qū)域。與IgA2相比，IgA1具有更長的富含O-聚糖且更靈活的鉸鏈區(qū)域。IgASAPSub1的消化位點位于該擴展區(qū)域，使酶具有IgA1特異性。IgA2亞類以三種等位基因形式存在，A2m1、A2m2和A2m3。IgASAPSub1+2在脯氨酸（P）和纈氨酸（V）之間消化IgA1和IgA2m1只有N端到鉸鏈區(qū)域，但由于A2m2和A2m3中的脯氨酸殘基被精氨酸（R）殘基取代，因此這兩種同種異體型的IgA2對消化具有抗性。這就是為什么Fc/2和GLP-1肽都被檢測為幾種變體。

與IdeS不同，Genovis的GingisREX（RgpB）是一種精氨酸特異性蛋白酶，可消化精氨酸殘基的C末端蛋白質，包括難以與其他酶消化的Arg-Pro鍵。該酶可用于肽圖分析、從頭肽測序和翻譯后修飾分析。精氨酸殘基的特異性C-末端消化；在其他困難的精氨酸-脯氨酸序列中可靠消化；產(chǎn)生更長的肽-提高序列覆蓋率。GingisREX是一種半胱氨酸蛋白酶，可特異性地消化肽鍵C末端到精氨酸殘基，包括與脯氨酸相連的精氨酸。半胱氨酸是酶活性所必需的。與胰蛋白酶消化相比，可生成更長的肽，胰蛋白酶消化可以通過高分辨率質譜進行分離和鑒定。這為自下而上方法的樣品制備提供了更多選擇，以實現(xiàn)替代的酶解曲線和更高的序列覆蓋率。GingisREX在賴氨酸上沒有活性，通常使用Arg-C觀察到。該酶在5.0-9.0的寬pH值范圍內(nèi)具有活性，它需要半胱氨酸并被鹽酸胍抑制。該酶是從牙齦卟啉單胞菌中純化的。GingisREX與胰蛋白酶消化相比，可生成更長的肽。陜西IdeS蛋白酶抗體酶切

IgASAP Sub1 可水解分泌物和血清 IgA1。山東GingisREXIdeS蛋白酶抗體酶切

與IdeS不同，融合蛋白是通過將兩種或多種蛋白質或肽的功能組合成一個量身定制的分子來創(chuàng)造的，以專門應對挑戰(zhàn)。連接此類蛋白質或肽結構域的常見方法是包含柔性連接子。這些連接子通常富含甘氨酸，例如甘氨酸殘基（G），或甘氨酸殘基散布絲氨酸殘基（GS）以形成重復序列。這為連接子提供了足夠的靈活性，不會干擾連接蛋白質結構域的功能。然而，這些新模式帶來了新的分析挑戰(zhàn)，需要新的工具來促進表征和產(chǎn)品質量監(jiān)測。中級分析已成為分析單克隆抗體療法的標準方法，涉及將分子消化成幾個定義的亞基。它們足夠小，可以獲得高質量的質譜圖，并為產(chǎn)品質量屬性提供特定領域的信息。由于G和GS連接子對常見蛋白酶的降解具有抗性，因此很難分離結構域以進行深入分析。因此，Genovis開發(fā)了GlySERIAS，不同于IdeS酶，一種消化柔性富含甘氨酸的連接子的酶。GlySERIAS可以分離不同的功能域，并實現(xiàn)對融合蛋白、多特異性抗體和含有富含甘氨酸的連接子的各種mAb片段進行詳細表征的中級方法。山東GingisREXIdeS蛋白酶抗體酶切