免疫共沉淀與免疫沉淀技術(shù)所使用的原理與方法大致相似,所不同的是,在免疫共沉淀中,對(duì)靶蛋白的結(jié)合與沉淀由另一個(gè)與之發(fā)生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基礎(chǔ)上,通過(guò)進(jìn)一步與其它技術(shù)的結(jié)合,如聚丙烯酰胺凝膠電泳,還可進(jìn)一步對(duì)靶蛋白的的分子量等特性進(jìn)行鑒定。
免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP):利用抗原抗體特異性反應(yīng),對(duì)某個(gè)特定蛋白純化富集的方法,主要過(guò)程包括捕獲和固定。(2)免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP):CoIP是在IP實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的擴(kuò)展,主要用于蛋白之間的互作研究,常被用于鑒定特定蛋白復(fù)合物的中已知或未知的蛋白組分。其原理是基于抗體與抗原(靶蛋白)之間的特異性結(jié)合,此時(shí)如果樣品溶液中存在能與靶蛋白相互作用的目的蛋白,會(huì)一同被拉下來(lái),隨后利用SDS-PAGE,WesternBlot等方法對(duì)得到的目標(biāo)蛋白進(jìn)行分析,進(jìn)而證明兩者間的相互作用。
Co-IP內(nèi)源檢測(cè)需注意抗體選擇、實(shí)驗(yàn)條件、樣本處理及驗(yàn)證,確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠!湖北免疫沉淀CoIP WB檢測(cè)
IP-WB(免疫沉淀-Western Blot)技術(shù)的缺點(diǎn)主要包括以下幾個(gè)方面:抗體特異性要求:IP-WB技術(shù)對(duì)抗體的特異性要求極高。如果抗體特異性不強(qiáng),可能會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合,增加背景噪聲,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。低豐度蛋白檢測(cè)難度:由于IP-WB技術(shù)的靈敏度限制,對(duì)于低豐度的蛋白質(zhì)相互作用,可能難以檢測(cè)到。操作復(fù)雜性:IP-WB技術(shù)涉及多個(gè)步驟,包括樣品制備、免疫沉淀、電泳分離和Western Blot檢測(cè)等,操作相對(duì)復(fù)雜,需要一定的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和技能。結(jié)果解讀難度:Western Blot結(jié)果可能受到多種因素的影響,如蛋白表達(dá)水平、抗體親和力等,結(jié)果解讀可能具有一定的難度。雖然IP-WB技術(shù)存在一些缺點(diǎn),但通過(guò)選擇特異性強(qiáng)的抗體、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件、提高實(shí)驗(yàn)技能等方法,可以很大程度地減少這些缺點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。湖北免疫沉淀CoIP WB檢測(cè)Co-IP技術(shù)可靠,但需注意潛在限制與影響因素,綜合驗(yàn)證確保準(zhǔn)確性!
CoIP-Mass和CoIP-WB檢測(cè)要點(diǎn):
互作蛋白篩選和驗(yàn)證:數(shù)據(jù)分析以非標(biāo)定量信號(hào)強(qiáng)度(LFQintensity和FC>10)作為強(qiáng)陽(yáng)篩選,以文獻(xiàn)查閱,功能匹配,批量CoIP-WB驗(yàn)證,提高驗(yàn)證成功率。理想CoIP-MS結(jié)果的蛋白定量都到超過(guò)1000種蛋白。其中絕大部分蛋白為非特異結(jié)合或背景蛋白。以目的蛋白的富集信號(hào)強(qiáng)度和差異倍數(shù)作為參考(相對(duì)強(qiáng)信號(hào)和差異),分析實(shí)驗(yàn)組中明顯定量較高且差異較大的蛋白,作為重要候選蛋白。同時(shí)對(duì)重要候選蛋白進(jìn)行STRING互作分析,文獻(xiàn)分析,目的蛋白功能匹配分析,選擇Top的4-5個(gè)蛋白進(jìn)行CoIP-WB驗(yàn)證,提高CoIP-WB成功率。
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)實(shí)驗(yàn)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用范圍。以下是其主要的應(yīng)用領(lǐng)域:1.蛋白質(zhì)相互作用研究(檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用/確定蛋白質(zhì)復(fù)合物的成員);2.細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)研究;3.蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)研究;4.疾病機(jī)制研究;5.其他應(yīng)用:蛋白純化,蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究。綜上所述,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)在蛋白質(zhì)相互作用研究、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)研究、蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)研究以及疾病機(jī)制研究等多個(gè)領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。Co-IP揭示蛋白互作,驗(yàn)證復(fù)合物形成,探究信號(hào)通路,助力蛋白研究!
CoIP-Mass應(yīng)用場(chǎng)景:CoIP-Mass:用于構(gòu)建目的蛋白的蛋白互作組數(shù)據(jù),或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作組差異。CoIP-WB:用于驗(yàn)證目的蛋白和候選蛋白的相互作用關(guān)系,或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作變化。
CoIP-Mass和CoIP-WB技術(shù)價(jià)值:(1)蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)是機(jī)制研究的重要基礎(chǔ)內(nèi)容,體現(xiàn)機(jī)制研究的嚴(yán)謹(jǐn)性,能明顯提高臨床基礎(chǔ)類研究文章的檔次。(2)細(xì)胞內(nèi)蛋白互作處于動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,在不同條件下可發(fā)生動(dòng)態(tài)變化,蛋白動(dòng)態(tài)互作組檢測(cè),是蛋白互作機(jī)制的亮點(diǎn)。(3)蛋白互作,往往是結(jié)構(gòu)域或部分關(guān)鍵區(qū)段的互作,可通過(guò)蛋白區(qū)段拆分,進(jìn)一步明確互作的結(jié)構(gòu)域,提升機(jī)制研究的高度,為靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化提供關(guān)鍵切入點(diǎn)。 Co-IP高特異靈敏,適用多樣本,兼容質(zhì)譜,操作簡(jiǎn)便,優(yōu)勢(shì)大!陜西免疫共沉淀檢測(cè)CoIP
Co-IP技術(shù)簡(jiǎn)便、特異、靈敏,是探索蛋白質(zhì)相互作用和疾病機(jī)制的重要工具!湖北免疫沉淀CoIP WB檢測(cè)
CoIP-Mass和CoIP-WB檢測(cè)要點(diǎn):
試驗(yàn)設(shè)計(jì):盡量進(jìn)行試驗(yàn)組別設(shè)計(jì)和進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)檢測(cè),提高后續(xù)驗(yàn)證的陽(yáng)性率。常規(guī)過(guò)表達(dá)單組(AbIPvsIgGIP);動(dòng)態(tài)互作組學(xué)(實(shí)驗(yàn)組vs對(duì)照組vsIg組)。根據(jù)目的設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)重復(fù)。如果后續(xù)以CoIP-Mass數(shù)據(jù)進(jìn)行互作組標(biāo)準(zhǔn)分析,則需要3-4組生物學(xué)重復(fù);如果后續(xù)以尋找關(guān)鍵互作蛋白,進(jìn)行機(jī)制深入研究,則建議1-2次生物學(xué)重復(fù)。經(jīng)驗(yàn)顯示單次重復(fù)假陽(yáng)性率90%。
蛋白表達(dá)和細(xì)胞量:細(xì)胞用量要求大(2-10e7細(xì)胞量),建議不少于5e7(金標(biāo)準(zhǔn):320g離心細(xì)胞量50μl,保障項(xiàng)目用量)。低表達(dá)蛋白,建議使用過(guò)表達(dá)組進(jìn)行檢測(cè)。蛋白表達(dá)可根據(jù)WB結(jié)果或初步根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)判定(ProteomicsDB;HumanProteinAtlas)。 湖北免疫沉淀CoIP WB檢測(cè)