從本節(jié)開始,我們開始對膜進(jìn)行深入討論和談一些應(yīng)用技巧。1. 蛋白與膜的結(jié)合原理。蛋白與膜的結(jié)合原理, 已知的結(jié)合力包括疏水作用力\H鍵\靜電作用力等,確切的結(jié)合原理并不明確,主要靠假說來支撐.主要有兩種假說:1 首先兩者靠靜電作用力結(jié)合, 然后靠H鍵和疏水作用來維持長時間結(jié)合.2首先兩者靠疏水作用結(jié)合, 然后靠靜電作用來維持長時間結(jié)合。兩條假說, 都表明其結(jié)合過程分為兩步, 首先結(jié)合和后面長時間結(jié)合.由于結(jié)合原理的不明確性, 導(dǎo)致在這方面的工作非常依賴實踐經(jīng)驗.2. 膜對結(jié)合的影響。 有些技術(shù)人員傾向使用膜孔徑來區(qū)分不同的膜,但是請注意這只只只限于同一廠家的產(chǎn)品,如果是不同廠家的產(chǎn)品,這種比較是無意義的. 膜孔徑與層析速度的關(guān)系,已在上文描述。PVDF轉(zhuǎn)印膜具有出色的粘附性能。溫州硝化纖維素轉(zhuǎn)印膜

隨著膜孔徑減小,膜的實際可用表面積遞增,膜結(jié)合蛋白的量也遞增. 估量表面積的參數(shù)為表面積比率(實際可用表面積與所用膜平面積的比率).另外, 膜孔徑越小,層析速度也越小,那么金標(biāo)復(fù)合物通過T線的時間也就越長,反應(yīng)也就越充分.綜合以上兩點,結(jié)論為膜孔徑越小靈敏度越高.但是同時也減慢了跑板速度,增加了非特異性結(jié)合的機(jī)會,也就是假陽性越高.所以要按照試驗結(jié)果挑選適合實際項目的膜,找到合適的平衡點。首先,單克隆抗體與膜的結(jié)合優(yōu)于多克隆抗體, 主要時由于多克隆抗體有很多不同的表面位點, 而各位點與膜的較佳結(jié)合條件都有細(xì)微的差別, 毫無疑問就增加了優(yōu)化難度。其次,分子量越大,蛋白越難結(jié)合到固相材料上。溫州硝化纖維素轉(zhuǎn)印膜膜材料可以靈活搭配不同的顏色和紋理。

硝酸纖維素膜（NC膜）在膠體金試紙中用做C/T線的承載體，同時也是免疫反應(yīng)的發(fā)生處。硝酸纖維素膜是蛋白印跡實驗的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，硝酸纖維素膜會吸附蛋白質(zhì)，但其作用機(jī)理目前仍不能確定，憑借這一特性，硝酸纖維素膜在生物學(xué)試驗中應(yīng)用普遍，是較重要的耗材之一。硝酸纖維素膜（簡稱NC膜）具有高蛋白結(jié)合能力和高機(jī)械強(qiáng)度、毛細(xì)管率與厚度一致、使用中不需要甲醇預(yù)濕等性能，是膠體金試紙中用做C/T線的承載體，同時也是免疫反應(yīng)試驗中較重要的耗材。另外，硝酸纖維素膜對于診斷層析試紙條的性能表現(xiàn)非常重要，是形成免疫復(fù)合物的固相支撐介質(zhì)，用戶直接在膜上判讀結(jié)果，病毒病情爆發(fā)后多用于病毒檢測試劑。

不同秒數(shù)的膜對反應(yīng)有什么影響呢？首先，我們分析一下液體在膜上的運(yùn)動過程。一張長度為4cm的膜， 每隔1cm做一個標(biāo)記， 當(dāng)液體運(yùn)動過標(biāo)記處時記錄時間點. 那么你將會發(fā)現(xiàn)液體在膜上的運(yùn)動是呈減速前行的。而兩張不同秒數(shù)的膜（例如135s， 180s）在同一時間標(biāo)記點處的運(yùn)動速度不同.這個試驗用清水做不好觀察，可以考慮用色素水溶液，非常明顯。那么從這個試驗可以看出，在通過同一T線噴點位置時，金溶液通過的速度是快速膜大于慢速膜。那么通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時間長，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時還有一個問題是，反應(yīng)時間越長，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過長時間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度。所以這里就有一個讀數(shù)時間/反應(yīng)靈敏度/非特異性結(jié)合的均衡。PVDF轉(zhuǎn)印膜材料能夠抵擋日常的化學(xué)腐蝕。

安裝轉(zhuǎn)印槽子：將濾紙和海綿放入電印跡緩沖液中浸泡一下，依次按照海綿、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、海綿的次序?qū)㈦娪≯E夾層裝好，并放入小型電轉(zhuǎn)槽中；電印跡轉(zhuǎn)移：于轉(zhuǎn)印條件下（50V，100-170mA）室溫進(jìn)行電印跡轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移時間一般為5-2小時（根據(jù)蛋白質(zhì)具體分子量大小而定）；PVDF膜染色前處理：取出PVDF膜并用去離子水漂洗，用甲醇浸泡數(shù)秒鐘，然后進(jìn)行染色；膜染色：染色劑30-50秒（切勿超過1分鐘)，50%甲醇脫色（勤換脫色液），之后用去離子水充分洗滌后晾干即可。轉(zhuǎn)印膜是一種經(jīng)濟(jì)型選擇，用于核酸和蛋白質(zhì)印跡實驗方案。這種硝化纖維素轉(zhuǎn)印膜，是Southern、colony/plaque以及蛋白質(zhì)實驗方案中較初使用的膜。NC HATF所含的混合纖維素酯基質(zhì)，不含在細(xì)胞生長過程中會干擾細(xì)胞壁完整性的表面活性劑。這些膜用于colony lifts。NC HAHY所含的混合纖維素酯基質(zhì)，所帶的表面活性劑能夠增強(qiáng)可濕性以及轉(zhuǎn)印過程中的處理能力。兩種膜對核酸和蛋白質(zhì)都具有高吸附容量。適用于常規(guī)轉(zhuǎn)印。膜材料能夠提高產(chǎn)品外觀的美觀性。溫州硝化纖維素轉(zhuǎn)印膜

膜材料易于裁剪、涂布和吸附。溫州硝化纖維素轉(zhuǎn)印膜

有兩種點樣方式,劃膜式和非接觸點膜式.非接觸點膜式優(yōu)于劃膜式,進(jìn)口劃膜式優(yōu)于國產(chǎn)劃膜式。因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面,而膜本身的物理性質(zhì)為軟脆,劃管會在其表面留下印痕.進(jìn)口的劃膜機(jī)由于使用的材料和控制系統(tǒng)較好,所以留下的劃痕較輕,而國產(chǎn)儀器較差,留下的劃痕也就比較嚴(yán)重. 劃痕容易對層析的金標(biāo)復(fù)合物形成阻力,導(dǎo)致假陽性. 同時容易出現(xiàn)跑板時在T線位置出現(xiàn)若有若無一條細(xì)線(鬼線),而跑板結(jié)束后鬼線消失的奇怪現(xiàn)象。膜的寬度一般有18mm(or 20mm)和25mm兩種, 分別使用在做測試條和做測試板上.然而,不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度. 點樣位置上移,金標(biāo)復(fù)合物通過T線位置時速度變慢,反應(yīng)時間增加,靈敏度升高. 反之靈敏度降低. 這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性。溫州硝化纖維素轉(zhuǎn)印膜