聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)：一種用于將兩個(gè)或多個(gè)含有互補(bǔ)序列的DN段拼接在一起的基因工程技術(shù)。連云港骨頭熒光定量PCR原理

絕大多數(shù)聚合酶鏈反應(yīng)方法依賴于熱循環(huán)。熱循環(huán)將反應(yīng)物暴露于加熱和冷卻的重復(fù)循環(huán)中，以允許不同的溫度依賴性反應(yīng)——具體地說，脫氧核糖核酸融化和酶-驅(qū)動(dòng)DNA復(fù)制。聚合酶鏈反應(yīng)使用兩種主要試劑-引物(引物是短的單鏈DN段，稱為寡核苷酸，是目標(biāo)DNA區(qū)域的互補(bǔ)序列)和DNA聚合酶。在PCR反應(yīng)的步，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈在高溫下物理分離，這個(gè)過程稱為脫氧核糖核酸變性。第二步，降低溫度，引物與互補(bǔ)的脫氧核糖核酸序列結(jié)合。這兩條DNA鏈就變成了模板，以酶促的方式從構(gòu)成DNA的自由核苷酸中組裝出一條新的DNA鏈。隨著聚合酶鏈反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)生的DNA本身被用作復(fù)制的模板，啟動(dòng)了一個(gè)連鎖反應(yīng)，原始的DNA模板是以指數(shù)形式放大。武漢細(xì)胞熒光定量PCR原理電子聚合酶鏈反應(yīng)是指計(jì)算工具使用給定的一組引物來擴(kuò)增來自測(cè)序的基因組或轉(zhuǎn)錄組的DNA 序列。

PCR的反應(yīng)條件：dNTP濃度過高會(huì)加快反應(yīng)速度，但同時(shí)還可以增加堿基的錯(cuò)誤摻入率。引物濃度過高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。TaqDNA聚合酶濃度過高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，低則合成產(chǎn)物量減少。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯(cuò)誤率達(dá)2*E-4個(gè)核苷酸，一個(gè)30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯(cuò)誤率。在90～95度下可使整個(gè)基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時(shí)間過長(zhǎng)使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合。引物長(zhǎng)度在15～25時(shí)退火溫度。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：PCR產(chǎn)物量過少：退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。DNA模板量太少。增加DNA模板量。PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。引物量不足。增加體系中引物含量。延伸時(shí)間太短。以1 kb/min的原則設(shè)置延伸時(shí)間。變性時(shí)間過長(zhǎng)。變性時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈。擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散：酶量過高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶。dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。聚合酶鏈反應(yīng)具有定量合成產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)。連云港骨頭熒光定量PCR原理

重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)用于連接含有基因、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段。連云港骨頭熒光定量PCR原理

聚合酶鏈反應(yīng)：在檢測(cè)病原體方面,病原體培養(yǎng)是臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn) .但是對(duì)于一些苛養(yǎng)菌 生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌或難以培養(yǎng)的病原體等培養(yǎng)的陽性檢出率不高.檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng) 無法滿足臨床早期快速診斷以指導(dǎo)醫(yī)治的需要[3]。當(dāng)前 PCR 技術(shù)是在傳統(tǒng) PCR 技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)上進(jìn)行的改進(jìn)，包括實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù) 、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR、 PCR-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 、 巢式PCR等。 在PCR技術(shù)的輔助作用下，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)也逐漸從生化免疫診斷過渡到基因診斷，生化免疫檢測(cè)主要從表型表現(xiàn)評(píng)估病癥，而基因診斷則深入本質(zhì)探究其病因，以PCR 技術(shù)為主的核酸技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與疾病診斷中表現(xiàn)出了明顯的應(yīng)用價(jià)值，在未來的臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中必將會(huì)得到更加較廣的應(yīng)用。連云港骨頭熒光定量PCR原理