聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：陰性：需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不但要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。嵌套式PCR在特異性擴(kuò)增長(zhǎng)DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功，但它需要更詳細(xì)的目標(biāo)序列知識(shí)。南京分子生物學(xué)PCR檢測(cè)技術(shù)技術(shù)服務(wù)

絕大多數(shù)聚合酶鏈反應(yīng)方法依賴于熱循環(huán)。熱循環(huán)將反應(yīng)物暴露于加熱和冷卻的重復(fù)循環(huán)中，以允許不同的溫度依賴性反應(yīng)——具體地說，脫氧核糖核酸融化和酶-驅(qū)動(dòng)DNA復(fù)制。聚合酶鏈反應(yīng)使用兩種主要試劑-引物(引物是短的單鏈DN段，稱為寡核苷酸，是目標(biāo)DNA區(qū)域的互補(bǔ)序列)和DNA聚合酶。在PCR反應(yīng)的步，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈在高溫下物理分離，這個(gè)過程稱為脫氧核糖核酸變性。第二步，降低溫度，引物與互補(bǔ)的脫氧核糖核酸序列結(jié)合。這兩條DNA鏈就變成了模板，以酶促的方式從構(gòu)成DNA的自由核苷酸中組裝出一條新的DNA鏈。隨著聚合酶鏈反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)生的DNA本身被用作復(fù)制的模板，啟動(dòng)了一個(gè)連鎖反應(yīng)，原始的DNA模板是以指數(shù)形式放大。廣州實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理聚合酶鏈反應(yīng)可以選擇這些突變來理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的，并改變或改善蛋白質(zhì)功能。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：MgCl2濃度過高。可適當(dāng)降低其用量。模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50 ng，而基因組DNA則應(yīng)<200 ng。引物濃度不夠優(yōu)化。對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。循環(huán)次數(shù)過多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時(shí)間及延伸時(shí)間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。退火溫度過低。電泳體系有問題：凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；凝膠沒有凝固好；瓊脂糖質(zhì)量差。若為PCR試劑盒則可能：由于運(yùn)輸儲(chǔ)存不當(dāng)引起試劑盒失效；試劑盒本身質(zhì)量有問題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些很好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。假陰性：不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克水平。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外迅速擴(kuò)增DN段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模版，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)形成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。電子PCR被提出作為分子生物學(xué)的教育工具。南京分子生物學(xué)PCR檢測(cè)技術(shù)技術(shù)服務(wù)

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合。南京分子生物學(xué)PCR檢測(cè)技術(shù)技術(shù)服務(wù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中很主要很常見的污染問題。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。還有一種容易忽視，很可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。南京分子生物學(xué)PCR檢測(cè)技術(shù)技術(shù)服務(wù)