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來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2022-06-21

聚合酶鏈反應(yīng)允許快速生產(chǎn)短DN段,即使已知的引物序列不超過(guò)兩個(gè)。聚合酶鏈反應(yīng)的這種能力增強(qiáng)了許多方法,例如生成雜交 探針用于 Southern 或northern blot 雜交。聚合酶鏈反應(yīng)為這些技術(shù)提供了大量的純DNA,有時(shí)是單鏈的,甚至可以從非常少量的起始材料中進(jìn)行分析。脫氧核糖核酸測(cè)序的任務(wù)也可以通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)輔助完成。已知的DN段可以很容易地從患有遺傳疾病突變的患者體內(nèi)產(chǎn)生。對(duì)擴(kuò)增技術(shù)的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段,或者可以產(chǎn)生感興趣區(qū)域的單鏈。聚合酶鏈反應(yīng)有許多應(yīng)用于傳統(tǒng)的 DNA克隆。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體,這可能只有少量可用。使用一組“載體引物”,它還可以分析或提取已經(jīng)插入載體的片段。聚合酶鏈反應(yīng)方案的一些改變可以產(chǎn)生突變(通用的或定點(diǎn)的)插入片段。嵌套式PCR在特異性擴(kuò)增長(zhǎng)DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功,但它需要更詳細(xì)的目標(biāo)序列知識(shí)。廈門特殊樣本數(shù)字PCR哪家好

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;引物的延伸:DNA模板-引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈,重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。廈門特殊樣本數(shù)字PCR哪家好聚合酶鏈反應(yīng)可用于產(chǎn)生突變基因,突變由科學(xué)家隨意選擇。

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):反應(yīng)的控制:PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子;鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高,常用1.5mmol/L;底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制,20~200umol/L;TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul);引物濃度一般為0.1 ~ 0.5umol/L;反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù);變性溫度和時(shí)間 95℃,30s;退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃;延伸溫度和時(shí)間 72℃,1min/kb(10kb內(nèi));Tm值=4(G+C) +2(A+T);循環(huán)次數(shù) :一般為25 ~ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低,可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右,循環(huán)數(shù)超過(guò)30個(gè)以后,DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和,產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加,出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。

聚合酶鏈反應(yīng):等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng):基于單核苷酸變異的診斷或克隆技術(shù)(snv不要與 SNPs 混淆)(患者的單堿基差異)。它需要事先知道DNA序列,包括等位基因之間的差異,并使用3’端包含SNV的引物(通常包含SNV周圍的堿基對(duì)緩沖液)。在模板和引物不匹配的情況下,嚴(yán)格條件下的PCR擴(kuò)增效率要低得多,因此用單核苷酸多態(tài)性特異性引物成功擴(kuò)增表明序列中存在特異性單核苷酸多態(tài)性。有關(guān)更多信息,請(qǐng)參見(jiàn)單核苷酸多態(tài)性基因分型。裝配聚合酶鏈反應(yīng)或者聚合酶循環(huán)組件:通過(guò)對(duì)具有短重疊片段的長(zhǎng)寡核苷酸池進(jìn)行PCR來(lái)人工合成長(zhǎng)DNA序列。寡核苷酸在有義和反義方向之間交替,重疊片段決定聚合酶鏈反應(yīng)片段的順序,從而選擇性地產(chǎn)生很終的長(zhǎng)DNA產(chǎn)物。電子聚合酶鏈反應(yīng)用于計(jì)算理論聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果。

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題:陰性:需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增,對(duì)策為:選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不但要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無(wú)條帶,此時(shí)做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長(zhǎng)度不夠,引物之間形成二聚體等。PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi),有些很好于當(dāng)日電泳檢測(cè),大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。寧波微量熒光定量PCR供應(yīng)商

聚合酶鏈反應(yīng)的一個(gè)主要限制是,為了產(chǎn)生允許其選擇性擴(kuò)增的引物,需要關(guān)于目標(biāo)序列的先前信息。廈門特殊樣本數(shù)字PCR哪家好

聚合酶鏈反應(yīng)注意事項(xiàng):在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過(guò)程中,注意避免mRNA的斷裂;為了防止非特異性擴(kuò)增,必須設(shè)陰性對(duì)照;內(nèi)參的設(shè)定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動(dòng)蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差;PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期,出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù),均應(yīng)通過(guò)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定;防止DNA的污染: 采用DNA酶處理RNA; 在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性。廈門特殊樣本數(shù)字PCR哪家好