Real-time PCR螢光染料摻入法:在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射螢光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何螢光信號(hào)，從而保證螢光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。此方法適用于：1、靈敏度高：使用SYBR可使螢光效果增強(qiáng)到1000倍以上。2、通用性好,不需要設(shè)計(jì)探針,方法簡(jiǎn)便,省時(shí),價(jià)格低廉。3、通用型方法，在國(guó)內(nèi)外科研中普遍使用。4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測(cè)。5、專一性要求不高的定量PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。杭州分子生物學(xué)數(shù)字PCR應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生物學(xué)研究的歷史中占據(jù)了重要的地位。以此為基礎(chǔ)發(fā)展出包括Real-time PCR在內(nèi)的多項(xiàng)應(yīng)用技術(shù)。自誕生后Real-time PCR技術(shù)持續(xù)發(fā)展，從簡(jiǎn)單的增擴(kuò)到整個(gè)PCR過程，Real-time PCR表現(xiàn)出比PCR更敏感、更明確的定量分析特性和對(duì)識(shí)別等位基因的能力。不少人以為real-time就是意味著可以在顯示器上看到每個(gè)循環(huán)增擴(kuò)曲線的增長(zhǎng)。事實(shí)并非如此，早期的軟件不能在運(yùn)行期間提供可視化的增擴(kuò)曲線。主要是因?yàn)镾DS軟件采用整個(gè)平臺(tái)較終的數(shù)據(jù)執(zhí)行數(shù)據(jù)分析工作，而不是分析每個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)循環(huán)。對(duì)某些設(shè)備來說，必須向分析軟件提供實(shí)時(shí)的數(shù)據(jù)，有些設(shè)備則不需要。前一種設(shè)備允許軟件實(shí)時(shí)跟蹤每個(gè)加樣口的增擴(kuò)曲線，同時(shí)顯示在電腦屏幕上。武漢微量數(shù)字PCR設(shè)計(jì)公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。

Real-time PCR探針法適用于：1、具有高適應(yīng)性和可靠性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定重複性好，特異性更高。2、適用于擴(kuò)增序列專一的體系的檢測(cè)。3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測(cè)。4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣較佳化引物設(shè)計(jì)條件都不能解決。5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，對(duì)特異性要求較高的定量。6、普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動(dòng)物病原體基因的檢測(cè),畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫,生物製品的鑒定。Real-time PCR探針法:PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的螢光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告螢光基團(tuán)和一個(gè)淬滅螢光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的螢光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告螢光基團(tuán)和淬滅螢光基團(tuán)分離，從而螢光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到螢光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)螢光分子形成，實(shí)現(xiàn)了螢光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR引物設(shè)計(jì)，PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。引物設(shè)計(jì)的基本原則：引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC很好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。

Real-time PCR鏈反應(yīng)注意事項(xiàng)：在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照；內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定；防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA；在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)可以將缺失、插入或點(diǎn)突變引入DNA序列。杭州分子生物學(xué)數(shù)字PCR應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。杭州分子生物學(xué)數(shù)字PCR應(yīng)用

Real-time PCR式反應(yīng)準(zhǔn)備：10×擴(kuò)增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）、引物（終濃度）、模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg2+（終濃度）、補(bǔ)加雙蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整，以上表格只提供大致參考值。PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。引物有多種設(shè)計(jì)方法，由PCR在實(shí)驗(yàn)中的目的決定，但基本原則相同。杭州分子生物學(xué)數(shù)字PCR應(yīng)用

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