膜片鉗法的各種模式:細胞吸附模式:將膜片微電極吸附在細胞膜上對但離子通道電流進行記錄的模式。其優(yōu)點是在細胞內(nèi)環(huán)境保持正常的條件下可以對離子通道活動進行觀察記錄。但是由于不能認為直接地控制細胞內(nèi)環(huán)境條件也不能確切的潘明細胞內(nèi)點位,所以其缺點是不清楚膜片上的實效點位。膜內(nèi)面向外模式:從細胞吸附模式將已形成巨阻抗封接的膜片微電極向上提起時,則膜片即從細胞體上被切割分隔下來,形成膜內(nèi)面向外的模式。常規(guī)全細胞模式:在細胞吸附模式上將膜打穿成孔,記錄膜片以外部位的全細胞膜的離子電流,這時全細胞模式。膜片鉗的數(shù)據(jù)如何處理:通過滲透很快改變胞漿成分并達到平衡。黃山藥理學膜片鉗設(shè)計公司
膜片鉗記錄的幾種形式:內(nèi)面向外膜片(inside-outpatch)高阻封接形成后,在將微管電極輕輕提起,使其與細胞分離,電極端形成密封小泡,在空氣中短暫暴露幾秒鐘后,小泡破裂再回到溶液中就得到“內(nèi)面向外”膜片。此時膜片兩側(cè)的膜電位由固定電位和電壓脈沖控制。浴槽電位是地電位,膜電位等于玻管電位的負值。如放大器的電流監(jiān)視器輸出是非反向的,則輸出將與膜電流(Im)的負值相等。外面向外膜片(out-sidepatch)高阻封接形成后,繼續(xù)以負壓抽吸,膜片破裂再將玻管慢慢地從細胞表面垂直地提起,斷端游離部分自行融合成脂質(zhì)雙層,此時高阻封接仍然存在。而膜外側(cè)面接觸浴槽液。溫州細胞生物學腦片膜片鉗方案膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用范圍:在心血管藥理方面的研究。
膜片鉗技術(shù)操作方法:開始封接:調(diào)低微操步進速度,使電極尖銳端慢慢向細胞靠近,如發(fā)現(xiàn)基線方波突然變小,封接電阻上升時,即停止電極下降,通過注射器給電極負壓,封接成功的可見方波很快變小,電阻升至G歐。此時,調(diào)節(jié)快電容補償按鈕,將快電容電流補償?shù)?,如封接穩(wěn)定后,準備破膜。破膜:在鉗制電位水平-60mV時,漏電流<20pA,給予比較大的負壓(也可根據(jù)情況使用ZAP電破方式破膜),將要破時可見基線上下浮動,破后,可見基線前后有兩個較大的慢電容電流。
膜片鉗電生理技術(shù)的記錄方式:全細胞記錄法,膜穿孔記錄法(perforatedpatchclamp),巨膜片鉗記錄法(giantmembranepatchclamp),松散封接記錄法(loosepatchclamp)等技術(shù)應(yīng)用:1.為了更換電極內(nèi)液和從電極內(nèi)施加藥物,發(fā)展了微電極內(nèi)灌技術(shù)(micropipetteperfusiontechnique)2.在研究細胞間的縫隙連接(gapjunction)通路時,發(fā)展了雙膜片鉗記錄法(doublepatchrecording)3.將富含神經(jīng)遞質(zhì)受體的游離膜片鉗靠近突觸部位,可檢測遞質(zhì)釋放和突觸活動,這一技術(shù)稱為膜片鉗探針技術(shù)(detector-patchtechnique)4.將特異的膜片探針插入卵母細胞,可檢測細胞內(nèi)第二信使含量,此為膜片填塞技術(shù)(patchcrammingtechnique)5.為研究細胞的胞吞與胞吐機制,發(fā)展了膜電容測定法(membranecapacitancemeasurement)。膜片鉗使用的注意事項:玻璃微電極需先用甲醇浸泡,再用酒精燈微燒兩端,使其平滑。
膜片鉗的技術(shù)原理:膜片鉗技術(shù)是用玻璃微電極吸管把只含1-3個離子通道、面積為幾個平方微米的細胞膜通過負壓吸引封接起來,由于電極尖銳端與細胞膜的高阻封接,在電極尖銳端籠罩下的那片膜事實上與膜的其他部分從電學上隔離,因此,此片膜內(nèi)開放所產(chǎn)生的電流流進玻璃吸管,用一個極為敏感的電流監(jiān)視器(膜片鉗放大器)測量此電流強度,就表示單一離子通道電流。膜片鉗技術(shù)的建立,對生物學科學特別是神經(jīng)科學是一具有重大意義的變革。這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜單一的(或多個)的離子通道分子活動的技術(shù)。此技術(shù)的出現(xiàn)自然將細胞水平和分子水平的生理學研究聯(lián)系在一起,同時又將神經(jīng)科學的不同分野必然地融匯在一起,改變了既往各個分野互不聯(lián)系、互不滲透,阻礙人們?nèi)空J識能力的弊端。全自動膜片鉗系統(tǒng)技術(shù)指標:藥液交換迅速。細胞內(nèi)、外液的交換是在平面芯片上進行。寧波藥理學腦片膜片鉗研究方案
膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用范圍:創(chuàng)新藥物研究與高通量篩選的研究。黃山藥理學膜片鉗設(shè)計公司
膜片鉗實驗中電極制備之分兩次拉制,首先次拉長7~10mm,直徑小于200μm,在此基礎(chǔ)上進行第二次拉制,較終使尖銳端的直徑為1~2μm,兩步拉制的目的主要是使電極前端的錐度變大,狹窄部長度縮短,因此可降低電極的串聯(lián)電阻,也可減少全細胞記錄時的電極液透析時間。由于膜片微電極較忌沾染灰塵和臟物,更忌觸碰尖銳端附近部位,所以一般要求在使用前制作。拋光:將電極固定于顯微鏡工作臺上,在鏡下將尖銳端靠近加熱絲,當通電加熱時,可見電極尖銳端微微回縮,此時電極變得光滑,且尖銳端的雜質(zhì)燒去,得到較干凈的表面。從而有利于和細胞膜緊密封接,并在封接后更易保持穩(wěn)定。黃山藥理學膜片鉗設(shè)計公司
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