冷凍電鏡技術(shù)基本原理之電鏡三維重構(gòu)理論：D.DeRosier和A.Klug提出三維重構(gòu)理論是借助一系列沿不同方向投影的電子顯微像來(lái)重構(gòu)被測(cè)物體的立體構(gòu)型，利用計(jì)算機(jī)數(shù)字圖像處理技術(shù)進(jìn)行電子顯微像三維重構(gòu)測(cè)定生物大分子結(jié)構(gòu)的概念和方法。透射電子顯微鏡成像過(guò)程中，電子束穿透樣品，將樣品的三維電勢(shì)密度分布函數(shù)沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上。運(yùn)用中心截面定理，從而可以通過(guò)三維物體不同角度的二維投影在計(jì)算機(jī)內(nèi)進(jìn)行三維重構(gòu)來(lái)解析獲得物體的三維結(jié)構(gòu)。主要使用的幾種冷凍電子顯微學(xué)技術(shù)結(jié)構(gòu)解析方法包括：電子晶體學(xué)、單顆粒重構(gòu)技術(shù)、電子斷層掃描等?；茨侠鋬鐾干潆娮语@微鏡技術(shù)方案

什么是冷凍電鏡技術(shù)？冷凍電鏡技術(shù)，全稱(chēng)是冷凍電子顯微鏡技術(shù)，是在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術(shù)。冷凍電鏡技術(shù)，是一種重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方法，它與X射線晶體學(xué)、核磁共振一起構(gòu)成了高分辨率結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。冷凍電鏡技術(shù)的研究，主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術(shù)。根據(jù)諾貝爾獎(jiǎng)評(píng)委會(huì)的說(shuō)法，冷凍電鏡技術(shù)使生物分子成像，變得更加簡(jiǎn)單，把生物化學(xué)帶入了一個(gè)新紀(jì)元。這項(xiàng)技術(shù)可以用來(lái)確定，溶液中生物分子的高清晰度結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)其實(shí)比較抽象，一直以來(lái)它主要的問(wèn)題是其圖像噪音極高、信號(hào)極低，研究的目標(biāo)是從中提取近原子分辨率的結(jié)構(gòu)信息。可以形象的比喻為在一個(gè)機(jī)器轟鳴的工廠，監(jiān)測(cè)一只螞蟻爬行的聲音。冷凍電鏡的目標(biāo)，就是要完成這項(xiàng)艱巨的任務(wù)。因此，可見(jiàn)這項(xiàng)技術(shù)成果的科學(xué)價(jià)值。宜昌快速冷凍顯微鏡技術(shù)特點(diǎn)冷凍電鏡技術(shù)的研究，主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術(shù)。

冷凍電鏡技術(shù)原理之電子斷層掃描成像技術(shù)：通過(guò)在顯微鏡內(nèi)傾轉(zhuǎn)樣品從而收集樣品多角度的電子顯微圖像并對(duì)這些電子顯微圖像根據(jù)傾轉(zhuǎn)幾何關(guān)系進(jìn)行重構(gòu)的方法稱(chēng)為電子斷層掃描成像技術(shù)。該方法主要應(yīng)用于細(xì)胞及亞細(xì)胞器，以及沒(méi)有固定結(jié)構(gòu)的生物大分子復(fù)合物(分子量范圍為800kD)，Zgao分辨率約2nm。冷凍電鏡的分類(lèi)：目前我們討論的冷凍電鏡基本上指的都是冷凍透射電鏡，但是如果我們以使用冷凍技術(shù)的角度定義冷凍電鏡的話，冷凍電鏡主要可以分為冷凍透射電鏡、冷凍掃描電鏡、冷凍蝕刻電子顯微鏡。

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的圖像處理技術(shù)：經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，目前冷凍電鏡的數(shù)據(jù)處理部分主要包含了以下的流程：(1)襯度傳遞函數(shù)的修正(CTFcorrection)；(2)樣品分子投影數(shù)據(jù)的篩選(particleselection)；(3)二維投影數(shù)據(jù)的分類(lèi)和降噪(2Danalysis)；(4)三維模型的重構(gòu)和優(yōu)化(3Dreconstructionandrefinement)；(5)多重構(gòu)象的結(jié)構(gòu)分析(heterogeneityanalysis)；(6)對(duì)重建結(jié)構(gòu)分辨率的分析(structureresolutionassessment)；(7)結(jié)合生物化學(xué)原理和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)三維結(jié)構(gòu)的解讀(modelinterpretationandvalidation)。冷凍電鏡技術(shù)之冷凍透射電鏡通常是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設(shè)備。

低溫透射電鏡技術(shù)的應(yīng)用：膠束體系對(duì)于濃度、pH、添加劑種類(lèi)等液相環(huán)境條件的變化非常敏感，如果是干燥狀態(tài)其結(jié)構(gòu)與有液相完全不同，因此必須用低溫透射電鏡表征其結(jié)構(gòu)。通常情況下，膠束有球狀、囊泡狀、棒狀、層狀、六角束狀、洋蔥狀、蠕蟲(chóng)狀等多種形狀，應(yīng)用低溫透射電鏡技術(shù)，囊泡、膠束的結(jié)構(gòu)可以被原位的真實(shí)呈現(xiàn)出來(lái)，可清晰地觀察到囊泡的完整性、分布、大小、融合等情況，而在普通電鏡條件下，干燥后的囊泡的形狀、結(jié)構(gòu)很容易發(fā)生變化。同樣，低溫透射電鏡也能夠有效保持聚合物在液相的形態(tài)，可清晰地觀察到聚合物的形態(tài)及聚集狀態(tài)。目前，低溫透射電鏡在生物大分子的成像尤其是蛋白結(jié)構(gòu)的解析方面已經(jīng)取得了諸多突破的成果，相信在化學(xué)分子材料領(lǐng)域也會(huì)展現(xiàn)很好的應(yīng)用前景。冷凍電鏡技術(shù)助力快速、高效的新藥研發(fā)。南京冷凍電子顯微鏡技術(shù)特點(diǎn)

冷凍電鏡技術(shù)可以通過(guò)揭示細(xì)胞里發(fā)生的生命過(guò)程細(xì)節(jié)，幫助人們了解很多有意思的生物學(xué)現(xiàn)象?；茨侠鋬鐾干潆娮语@微鏡技術(shù)方案

冷凍電鏡技術(shù)工作流程：首先是樣品制備。高純度、高濃度的蛋白樣品溶液被滴在一個(gè)特制的樣品載網(wǎng)上面。載網(wǎng)由一張布滿小孔的超薄非晶碳薄膜和金屬支撐框架組成，在表面張力的作用下，微孔上會(huì)形成一層跨孔的薄水膜。將多余溶液吸走后，把載有蛋白溶液超薄膜的載網(wǎng)迅速投入到液態(tài)乙烷冷凍劑中使其快速冷凍，從而使蛋白質(zhì)分散固定在玻璃態(tài)的冰膜中。然后電鏡圖像采集。選擇較有可能產(chǎn)生較佳圖像的較佳顆粒密度和玻璃態(tài)冰厚度的樣品?；茨侠鋬鐾干潆娮语@微鏡技術(shù)方案