膜片鉗技術(shù)本質(zhì)上也屬于電壓鉗范疇,兩者的區(qū)別關(guān)鍵在于:①膜電位固定的方法不同;②電位固定的細胞膜面積不同,進而所研究的離子通道數(shù)目不同。電壓鉗技術(shù)主要是通過保持細胞跨膜電位不變,并迅速控制其數(shù)值,以觀察在不同膜電位條件下膜電流情況。因此只能用來研究整個細胞膜或一大塊細胞膜上所有離子通道活動。目前電壓鉗主要用于巨大細胞的全性能電流的研究,特別在分子克隆的卵母細胞表達電流的鑒定中發(fā)揮著其他技術(shù)不能替代的作用。傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)膜片鉗系統(tǒng)由人工操作,實驗人員在取得元代細胞。合肥神經(jīng)生物學(xué)離子通道
膜片鉗記錄的幾種形式:內(nèi)面向外膜片(inside-out patch) 高阻封接形成后,在將微管電極輕輕提起,使其與細胞分離,電極端形成密封小泡,在空氣中短暫暴露幾秒鐘后,小泡破裂再回到溶液中就得到“內(nèi)面向外”膜片。此時膜片兩側(cè)的膜電位由固定電位和電壓脈沖控制。浴槽電位是地電位,膜電位等于玻管電位的負值。如放大器的電流監(jiān)視器輸出是非反向的,則輸出將與膜電流(Im)的負值相等。外面向外膜片(out-side patch) 高阻封接形成后,繼續(xù)以負壓抽吸,膜片破裂再將玻管慢慢地從細胞表面垂直地提起,斷端游離部分自行融合成脂質(zhì)雙層,此時高阻封接仍然存在。而膜外側(cè)面接觸浴槽液。合肥醫(yī)學(xué)腦定位膜片鉗技術(shù)膜片鉗實驗操作的過程中,總會遇到各種各樣的問題,對實驗人員造成很多困擾。
膜片鉗技術(shù)在通道研究中的重要作用:1.與藥物作用有關(guān)的心肌離子通道:心肌細胞通過各種離子通道對膜電位和動作電位穩(wěn)態(tài)的維持而保持正常的功能。近年來,國外學(xué)者在人類心肌細胞離子通道特性的研究中取得了許多進展,使得心肌藥理學(xué)實驗由動物細胞模型向人心肌細胞成為可能。2.對離子通道生理與病理情況下作用機制的研究:通過對各種生理或病理情況下細胞膜某種離子通道特性的研究,了解該離子的生理意義及其在疾病過程中的作用機制。
膜片鉗使用操作流程及注意事項:1.實驗結(jié)束后必須關(guān)閉實驗室的水電,檢查實驗室門窗。2.凡是在本平臺使用儀器的同學(xué)必須履行實驗室相關(guān)要求,完成值日等相關(guān)工作(值日生按照實驗室統(tǒng)一所發(fā)值日生要求履職)。3.在儀器使用以前及使用之后按按照使用時長做好登記工作。4.拉制儀提前預(yù)熱(至少30min)。且用完及時關(guān)閉。電熱加熱線溫度很高,在使用時注意避免燙傷。4.電腦里面的軟件不得隨意刪改,不得在本機電腦下載別的軟件,拷數(shù)據(jù)時需用實驗室配置的U盤。5.禁止私拉電線,如有實驗要求可與老師及時溝通。膜片鉗技術(shù)用特制的玻璃微吸管吸附于細胞表面,使之形成10~100MΩ的高阻封接,被孤立的小膜片面積為微米數(shù)量級,因此封接范圍內(nèi)細胞膜光有少數(shù)離子通道。膜片鉗系統(tǒng)有如下應(yīng)用局限性:細胞有比較強的細胞膜可以禁得起各種人為操作。
膜片鉗操作實驗:在大多數(shù)膜片鉗實驗,要求所有實驗儀器及設(shè)備均具有良好的機械穩(wěn)定性,以使微電極與細胞膜之間的相對運動盡可能小。防震工作臺放置倒置顯微鏡和與之固定連接的微操縱器,其他設(shè)備置于臺外。屏蔽罩由銅絲網(wǎng)制成,接地以防止周圍環(huán)境的雜散電場對膜片鉗放大器的探頭電路的干擾。儀器設(shè)備架要靠近工作臺,便于測量儀器與光學(xué)儀器配接。倒置顯微鏡是膜片鉗實驗系統(tǒng)的主要光學(xué)部件,它不光具有較好的視覺效果,便于將玻璃電極與細胞的頂部接觸,而且是借助移動物鏡來實現(xiàn)聚焦,具有較好的機械穩(wěn)定性。視頻監(jiān)視器主要是用來監(jiān)視實驗過程中的操作,特別是能將封接參數(shù)(如封接阻抗)與細胞的形態(tài)對應(yīng),以實現(xiàn)良好的封接。膜片鉗使用的注意事項:在放大器打開時不能用手、金屬物品或其它導(dǎo)電的物品接觸電極絲。合肥醫(yī)學(xué)腦定位膜片鉗技術(shù)
膜片鉗的數(shù)據(jù)如何處理:電極管內(nèi)與細胞之間彌散交換與平衡快,因而容易控制細胞內(nèi)液的成分。合肥神經(jīng)生物學(xué)離子通道
全細胞膜片鉗模式下有電壓鉗記錄和電流鉗記錄兩種。電壓鉗記錄的原理與電壓鉗技術(shù)相似,但有所不同:首先,全細胞電壓鉗記錄只使用單根電極,但在電學(xué)效果上同時實現(xiàn)了電壓鉗制和電流記錄。其次,電壓鉗記錄的電極不細胞,對細胞造成的損傷較小,因而能用于小細胞如神經(jīng)元的研究。電流鉗記錄則是通過鉗制電極電流來測量膜電位。電流鉗在本質(zhì)上也是電壓鉗位,它將差分放大器的輸出電流與指令電流相比較,然后將這個差動輸出施加到放大器前級的倒相端,通過高速反饋使得同相端的電壓與其相等,無論電極電流是否為零,都能從輸出電壓得到膜電位的準確數(shù)值。合肥神經(jīng)生物學(xué)離子通道